外源油菜素內(nèi)酯對玉米幼苗鎘毒害耐受性的影響

王 芳，彭云玲，方永豐，慕 平，王 威，張文姣

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

鎘(Cadmium，Cd)是生物毒性很強的重金屬，被稱為“五毒之首”，在自然界中常與鋅、銅、鉛并存，主要通過對水源的直接污染，以及通過食物鏈的富集作用對人類健康造成危害。隨著工業(yè)化和城市化的發(fā)展，農(nóng)田土壤和水體重金屬鎘累積超標(biāo)問題日益嚴重，含鎘的污染物通過各種途徑進入土壤，使農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量下降，從而危害人類的健康，并導(dǎo)致大氣和水環(huán)境質(zhì)量的進一步惡化[1]。利用外源物質(zhì)對植物進行處理，是目前提高植物抗逆性簡便、可行的方法之一。油菜素內(nèi)酯是第一個被分離出的具有活性的油菜素甾族化合物(Brassinosteroids，BRs)，是國際上公認的活性最高、最廣譜的一類植物生長激素，可以激發(fā)植物內(nèi)在潛能，促進作物生長，改善高溫、重金屬、干旱、低氧等不良環(huán)境下植物的抗氧化性能，減少其膜脂過氧化程度，從而促進植物的光合作用及干物質(zhì)積累，使作物耐逆性增強，增加作物產(chǎn)量[2]。馬梅等[3]研究表明，外源油菜素內(nèi)酯可以改善鹽脅迫下油菜幼苗的滲透調(diào)節(jié)和離子穩(wěn)態(tài)，促進其在鹽脅迫下的光合作用和生物量積累。宋吉軒等[4]研究表明油菜素內(nèi)酯能有效減緩干旱脅迫對羊草造成的傷害，提高羊草株高、葉面積和光合色素含量，促進干物質(zhì)積累，降低膜脂過氧化產(chǎn)物MDA與質(zhì)膜透性，提高脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，增強抗氧化酶活性。外源油菜素內(nèi)酯可減輕NaCl脅迫下棉花葉片受抑制程度，從而使NaCl脅迫下棉花葉片生理功能增強，生物量增加[5]。外源 EBR 處理可調(diào)節(jié)辣椒根系形態(tài)和提高根系抗氧化酶活性，增強植株抗低溫脅迫的能力[6]。然而，有關(guān)油菜素內(nèi)酯在提高植物抗重金屬方面的研究卻鮮有報道。玉米(ZeamaysL.)是我國最重要的糧食作物之一，適應(yīng)性強、產(chǎn)量高，是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料作物。為此，本試驗以玉米為材料，研究了外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗生理機制的影響，探討油菜素內(nèi)酯緩解鎘脅迫的生理機理，以明確油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗的保護機制，為探明油菜素內(nèi)酯減輕植物鎘毒害的機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗玉米品種為“鄭單958”玉米種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 試材培育 挑選飽滿均一的玉米種子，用0.1%的次氯酸鈉消毒10 min后，漂洗干凈，在25℃下，以蒸餾水浸種12 h后播種到墊有兩層濾紙的直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，置于25℃培養(yǎng)箱中，玉米出苗后，選取生長一致的三葉一心期的幼苗轉(zhuǎn)移到塑料花盆中，每盆植苗8株，于人工氣候室內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每2 d用1/5濃度的Hoaglands營養(yǎng)液澆灌，待第4片葉長出后，選取長勢良好和長勢一致的玉米幼苗進行鎘脅迫試驗。

1.2.2 試驗處理 配置油菜素內(nèi)酯水溶液0.1%的母液，4℃下保存，用時按所需濃度稀釋。試驗首先根據(jù)前期試驗研究的結(jié)果，選取100 mg·L-1Cd2+作為脅迫條件[7]，油菜素內(nèi)酯溶液的濃度設(shè)定0，0.004%，0.008%，0.012%，0.016% 6個濃度處理：

CK對照，Hoagland溶液；

T1：含100 mg·L-1Cd2+的Hoagland溶液；

T2：含100 mg·L-1Cd2+和0.004%油菜素內(nèi)酯的Hoagland溶液；

T3：含100 mg·L-1Cd2+和0.008%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液；

T4：含100 mg·L-1Cd2+和0.012%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液；

T5：含100 mg·L-1Cd2+和0.016%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液。

處理7 d后取玉米幼苗第二片功能葉進行各項生理指標(biāo)的測定，每個指標(biāo)測定3次，求平均值。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長量的測定 每處理隨機挑選10株幼苗，用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3次，用吸水紙吸干植株表面的殘留水分，依次用直尺測定其根長、株高。將上述取樣植株分成地上、地下兩部分，先稱鮮重，然后置于烘箱內(nèi)，105℃下殺青30 min，80℃恒溫烘干稱重，并計算單株苗鮮/干重，3次重復(fù)。

1.3.2 生理指標(biāo)的測定 SOD活性的測定采用NBT光化還原法[8]，用分光光度計測定560 nm處的吸光值，以NBT光化還原被抑制50%的酶液量為1個酶活單位。POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[8]，在470 nm處以30 s為間隔作2 min的時間掃描，以1 min內(nèi)OD470值變化的0.01為1個酶活力單位。CAT活性的測定采用紫外分光光度法[8]，以1 min內(nèi)OD240值變化的0.1為1個酶活性單位。丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[9]。游離脯氨酸含量的測定采用茚三酮顯色法[9]；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[9]；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[9]；葉綠素含量的測定采用丙酮乙醇混合液提取法[10]；葉片含水量的測定采用蒸餾水浸泡法[10]；電導(dǎo)率的測定采用雙蒸水煮沸法[10]；根系活力的測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2003進行繪圖，用SPSS 16.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗生長的影響

由表1可以看出，與對照相比，鎘脅迫(T1)處理下玉米幼苗生物量顯著下降，添加不同濃度的油菜素內(nèi)酯后， T2，T3，T4，T5處理均較T1顯著增加，表明油菜素內(nèi)酯可以緩解鎘毒害對玉米幼苗生長的影響，其中，T4處理的緩解效果最明顯。

2.2 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖1A可知，在T1處理下玉米幼苗的POD活性顯著下降，較對照降低了7.59%(葉)和10.2%(根)。與T1相比，添加不同濃度的油菜素內(nèi)酯后，T2、T3、T4、T5各處理玉米幼苗的POD活性明顯上升，分別上升了0.33%、1.79%、4.21%、1.84%(葉)和5.4%、8.8%、5.0%、0.1%(根)。由圖1B可知，在T1處理下，玉米幼苗中SOD含量顯著下降，與對照相比，下降了46.16%(葉)和3.2%(根)。T2、T3、T4、T5處理與T1相比SOD含量均有所增加，分別增加了15.66%、18.64%、67.2%、34.36%(葉)和2.3%、3.2%、0.5%、0.9%(根)。由圖1C可知，在T1處理下玉米幼苗CAT活性顯著降低，較對照下降了14.61%(葉)和18.5%(根)，T2、T3、T4、T5處理與T1相比，CAT活性均有所增加，分別增加了3.27%、5.00%、13.98%、5.57%(葉)和13.9%、14.6%、7.5%、9.4%(根)。就同一處理條件下，其葉片的CAT活性低于根的，POD和SOD活性高于根的，但其總體變化趨勢是一致的。

表1外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗生長的影響

Table 1 Effect of exogenous brassinosteroid on maize seedling growth under Cd stress

處理Treatment地上鮮重/(g·plant-1)Shoot fresh weight地上干重/(g·plant-1)Shoot dry weight地下鮮重/(g·plant-1)Root fresh weight地下干重/(g·plant-1)Root dry weight根長/cmRoot length株高/cmHeightCK2.35783a0.15257a1.43237b0.11950a21.02a30.37bT11.62763c0.11863b1.25870c0.10890b17.32f28.85cT21.90549b0.13510b1.34080c0.11917a19.43e31.35bT32.18577b0.14967a1.35327c0.12250a19.70d31.84aT42.59070a0.18243a1.70510a0.13897a20.31b32.15aT52.58231a0.18137a1.44510b0.11520b20.01c32.07a

注：不同小寫字母代表不同處理間在0.05水平差異顯著，下同。

Note：Different small letters show a significant difference at the 0.05 level among the treatments. The same as below.

注：不同小寫字母代表不同處理間在0. 05水平差異顯著，下同Note：Different small letters show a significant difference at the 0.05 level among the treatments, the same below.圖1 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性的影響Fig.1 Effect of exogenous brassinosteroid on the POD、SOD、 CAT activity of maize seedling under Cd stress

2.3 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗MDA含量和質(zhì)膜透性的影響

由圖2A可知，在單獨鎘脅迫T1處理下玉米幼苗MDA含量顯著上升，與對照相比上升了38.56%(葉)和73.2%(根)，而在添加了不同濃度的油菜素內(nèi)酯的T2、T3、T4、T5處理下，MDA含量相對于T1均有所下降，分別降低了13.31%、24.72%、30.01%、0.83%(葉)和28.6%、22.0%、32.6%、27.3%(根)。由圖2B可以看出，與對照相比，T1處理后玉米幼苗質(zhì)膜透性顯著增加，增加了73.83%(葉)和55.8%(根)。T2、T3、T4、T5與T1相比，玉米幼苗的質(zhì)膜透性均下降，分別下降了4.16%、7.60%、39.38%、32.86%(葉)和11.7%、18.7%、29.0%、21.0%(根)。就同一處理條件下，其葉片的MDA含量低于根的，質(zhì)膜透性高于根的，但其總體變化趨勢是一致的。

2.4 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響

由圖3A可以看出，與對照相比，在T1處理下玉米幼苗中可溶性糖含量顯著降低，降低了62.94%(葉)和34.9%(根)。在T2、T3、T4、T5處理下，玉米幼苗中可溶性糖含量相對于T1均增加，分別增加了8.33%、13.62%、53.15%、0.35%(葉)和15.5%、20.2%、35.5%、7.9%(根)。

圖2 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗MDA含量和質(zhì)膜透性的影響Fig.2 Effect of exogenous brassinosteroid on the MDA content and membrane permeability of maize seedling under Cd stress

圖3 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of exogenous brassinosteroid on the soluble sugar, soluble protein and proline content of maize seedling under Cd stress

由圖3B可知，T1處理下玉米幼苗可溶性蛋白含量較對照顯著降低，降低了49.78%(葉)和46.9%(根)。T2、T3、T4、T5處理與T1相比可溶性蛋白含量均上升，分別上升了14.21%、61.35%、98.34%、58.64%(葉)和27.9%、33.2%、57.5%、39.5%(根)。其中，T4處理的玉米幼苗可溶性蛋白含量上升最為明顯。由3C可知，在T1處理下玉米幼苗中脯氨酸含量顯著下降，相對于對照下降了62.69%(葉)和50.8%(根)。T2、T3、T4、T5處理下玉米幼苗中脯氨酸含量與T1相比均上升，分別上升了18.51%、27.19%、79.28%、26.22%(葉)和12.9%、55.3%、25.9%、0.6%(根)。就同一處理條件下，其葉片的可溶性蛋白和可溶性糖含量低于根的，脯氨酸含量高于根的，但其總體變化趨勢是一致的。

2.5 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗葉片葉綠素的影響

從圖4看出，與對照相比，T1處理下玉米幼苗葉片葉綠素含量顯著下降，下降了74.24%。T2、T3、T4、T5處理與T1相比，玉米幼苗葉綠素含量均上升，分別增加了36.54%、56.38%、90.08%、1.87%?？梢?，T4處理下葉綠素含量最高。

圖4 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗葉片葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of exogenous brassinosteroid on chlorophyll contentin leaves of maize seedling under Cd stress

2.6 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗葉片相對含水量的影響

從圖5中可以看出，與對照相比，T1處理后玉米幼苗葉片含水量顯著降低，下降了6.40%。說明當(dāng)玉米幼苗受鎘脅迫時細胞組織遭到破壞。T2、T3、T4、T5與T1相比，玉米幼苗的相對含水量均有所上升，分別上升了1.59%、2.71%、4.87%、1.79%?？梢姡k脅迫下，T4處理下玉米幼苗細胞損壞程度最小，與其它處理也有顯著性差異。

2.7 油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗根系活力的影響

由圖6可見，T1處理與對照相比，玉米幼苗根系活力顯著降低，降低了48.38%，T2、T3、T4、T5處理與T1處理相比，玉米幼苗根系活力明顯上升，分別上升了23.65%、30.10%、41.08%、23.65%。T4處理下玉米幼苗根系活力上升幅度最大。

圖5 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗葉片相對含水量的影響Fig.5 Effect of exogenous brassinosteroid on leaf water contentin leaves of maize seedling under Cd stress

圖6 外源油菜素內(nèi)酯對鎘脅迫下玉米幼苗根系活力的影響Fig.6 Effect of exogenous brassinosteroid on root activityof maize seedling under Cd stress

3 討 論

環(huán)境污染中最突出的是重金屬污染，近年來，隨著采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬超標(biāo)制品等人類活動導(dǎo)致環(huán)境中的重金屬含量增加，超出正常范圍，直接危害人體健康，并導(dǎo)致環(huán)境惡化[11]。通常植物在受到重金屬污染時都會出現(xiàn)生長遲緩、植株矮小、根系伸長受抑制直至停止、葉片褪綠、出現(xiàn)褐斑等癥狀，嚴重時甚至導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低和植物死亡。鎘是廣泛存在于自然界中的毒性最強的重金屬之一，為植物的非必需元素，進入植物體并積累到一定含量后會破壞生物細胞的結(jié)構(gòu)功能[12]，鎘對植物的危害首先體現(xiàn)在種子的萌發(fā)與幼苗的生長上。油菜素內(nèi)酯作為一種植物激素在提高作物抗逆性方面起重要作用[13]，本試驗通過用不同濃度油菜素內(nèi)酯對重金屬鎘脅迫下玉米幼苗生理特性進行研究，結(jié)果表明，一定濃度的油菜素內(nèi)酯(0.012%)可以顯著提高玉米幼苗植株的抗性，促進玉米幼苗生長和正常生理機能的進行。這與Hasan等[14]研究外源表油菜素內(nèi)酯(EBL)改善Cd脅迫下番茄幼苗的生長狀況一致。Sharma[15]等研究也證實EBL緩解重金屬脅迫下芥菜的生長及生物量。

正常生理狀態(tài)下，由于植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除作用，植物體產(chǎn)生的自由基和清除自由基的速率處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但當(dāng)植物受到逆境脅迫時，體內(nèi)自由基產(chǎn)生增多，活性氧含量會增加，破壞了他們之間的動態(tài)平衡，對機體的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成損傷。SOD、CAT、POD是機體抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，能通過有效清除氧自由基來減輕脂質(zhì)過氧化對機體造成的損傷[16]。Rady[17]等研究表明，EBL處理的菜豆在鎘脅迫下可保持較高的抗氧化酶活性，吳雪霞[16]等研究也報導(dǎo)適宜濃度EBL能夠提高高溫脅迫下茄子幼苗抗氧化酶活性，從而提高植物耐受性。本試驗結(jié)果表明，鎘脅迫下玉米幼苗SOD、CAT、POD活性相對于對照組都有大幅度的下降，加入一定濃度的油菜素內(nèi)酯后有不同程度的緩解作用。

脂質(zhì)過氧化能夠嚴重損傷植物的細胞膜系統(tǒng)，破壞葉綠體和線粒體的超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致葉綠體降解，光合酶等多種酶活性下降。MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，MDA含量的高低顯示了脂質(zhì)過氧化作用的強弱程度。電導(dǎo)率是衡量植株細胞內(nèi)容物擴散的一項生理指標(biāo)，也可作為細胞組織幼嫩程度和細胞質(zhì)膜是否受到傷害的指標(biāo)[18]。本試驗結(jié)果表明，Cd脅迫下玉米葉片MDA含量和質(zhì)膜透性顯著增高，在0.012%濃度的油菜素內(nèi)酯處理下MDA含量和質(zhì)膜透性顯著降低，說明油菜素內(nèi)酯緩解了鎘毒害下玉米幼苗細胞膜受傷害的程度。Hasan[14]的研究也曾報導(dǎo)EBL處理顯著降低了番茄植株體內(nèi)MDA含量，減輕了植物傷害。同樣郭本森[19]等研究了表油菜素內(nèi)酯對大麥抽穗后期葉的生理特性的影響，結(jié)果表明在大麥抽穗后期用EBR噴灑能使細胞膜透性明顯降低，會在一定程度上抑制葉片膜質(zhì)過氧化的發(fā)生，提高大麥的抗逆性。

滲透調(diào)節(jié)是植物在脅迫條件下主動增加細胞溶質(zhì)含量，降低植株水勢，保持細胞水勢以抵抗逆境的一種方式[20]?？扇苄蕴悄芴峁┠茉次镔|(zhì)，維持蛋白質(zhì)滲透壓穩(wěn)定，重金屬離子進入植物后，能與其它化合物合成金屬絡(luò)合物或螯合物，抑制植物各種代謝活動尤其是蛋白質(zhì)的合成。脯氨酸是干旱、高鹽、高溫、冰凍和重金屬等逆境脅迫下植物體內(nèi)積累的主要滲透物質(zhì)[21]。本試驗測定結(jié)果表明，鎘處理下植物幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量較對照均下降，加入油菜素內(nèi)酯后會有不同程度的上升。一定濃度的鎘離子溶液可導(dǎo)致量下降，主要因為鎘進入細胞后促進蛋白水解酶的活性，加強了原有蛋白質(zhì)分解；同時鎘對蛋白合成的眾多酶系均有毒害和鈍化作用，并且會使蛋白質(zhì)合成的相關(guān)細胞器受到損傷，抑制新蛋白的合成。這與喬琳[22]等研究外源油菜素內(nèi)酯對鉛毒害玉米幼苗的結(jié)論相一致。

葉綠素是植物進行光合作用合成有機物的光合色素，其含量的多少反映了植物光合作用能力的大小。有研究表明，油菜素內(nèi)酯能通過促進小麥等植物葉片的RuBP羧化酶的活性、提高葉綠素含量[23]。本試驗結(jié)果表明鎘毒害降低了玉米植株葉綠素的含量，使光合作用能力變小，適宜濃度的油菜素內(nèi)酯可以顯著提高鎘脅迫下玉米幼苗葉片中葉綠素的含量，使光合作用正常進行，有效緩解鎘對玉米幼苗的脅迫作用。沈秀瑛[24]用BR處理玉米葉片后葉綠素含量明顯增加。翁曉燕[25]等研究表明抽穗后的水稻經(jīng)油菜素內(nèi)酯處理，其葉綠素含量及凈光合速率都高于對照，這與本試驗得出的結(jié)論一致。

4 結(jié) 論

在單純鎘脅迫處理下玉米幼苗的生長量(干重、鮮重、株高)、抗氧化酶(SAT/POD/SOD)活性、可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量、葉綠素含量、葉片含水量相對于對照都會降低，同時，植株的MDA含量和電導(dǎo)率會增加，這說明重金屬鎘會對玉米幼苗產(chǎn)生一定的毒害作用，使其酶活性降低，破壞細胞組織結(jié)構(gòu)而影響其一系列的生理特性。而當(dāng)加入油菜素內(nèi)酯后會對酶活性以及其它生理特性有一定的緩解作用，其中以0.012% 濃度緩解效果最明顯，這說明油菜素內(nèi)酯對玉米幼苗鎘毒害的耐受性有一定的緩解作用。