遺傳因素參與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病的研究進展*

郭 露 綜述，李祿全 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014)

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)是新生兒尤其是早產(chǎn)兒常見的嚴重疾病，目前認為NEC的發(fā)生可能與早產(chǎn)、低出生體重、腸內(nèi)喂養(yǎng)、腸道菌群失衡、感染、圍生期窒息等有關(guān)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)NEC發(fā)病風(fēng)險因種族而異，如早產(chǎn)人群中瑞士和奧地利的發(fā)病率較北美和愛爾蘭低，非裔美國人嬰兒比白種人更易患NEC，進一步研究表明NEC發(fā)病還與遺傳因素密切相關(guān)[2]。利用候選基因法，研究者們發(fā)現(xiàn)了許多與NEC相關(guān)的基因，例如既往研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體 4(TLR4)通路與NEC發(fā)病密切相關(guān)，動物研究表明TLR4突變小鼠NEC發(fā)病率降低，對NEC患兒進行研究亦發(fā)現(xiàn)與TLR4相關(guān)的基因變異與NEC發(fā)病率及嚴重程度相關(guān)，類似的研究發(fā)現(xiàn)如核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白受體2(NOD2)、甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)等信號通路及生長因子、炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)基因突變也與NEC發(fā)病密切相關(guān)。隨著全基因組測序及二代測序的不斷發(fā)展，少部分研究采用全基因組測序的方法對比NEC與其他疾病患者的全基因組信息，發(fā)現(xiàn)存在極大差異，越來越多與NEC相關(guān)的遺傳信息正在被破譯[3]。本文綜述近年來發(fā)現(xiàn)的基因突變參與NEC發(fā)病的研究進展如下。

1 模式識別受體(PRR)及相關(guān)信號通路變異

PRR是識別病原體中保守結(jié)構(gòu)基序并激活腸道免疫反應(yīng)的先天免疫受體，在腸道對共生生物的免疫耐受、對入侵病原體的免疫激活及腸道炎癥調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，PRR通過一系列復(fù)雜的信號通路發(fā)揮免疫作用。因而大量與NEC相關(guān)的遺傳研究集中在PRR及信號通路相關(guān)的基因，包括Toll樣受體、NOD2、MBL途徑。

1.1TLR突變 TLR通路在腸道的先天免疫調(diào)節(jié)及識別病原體、清除細菌、誘導(dǎo)炎癥細胞和腸道干細胞的增殖和遷移等過程中起重要作用，其家族有10多個成員，分別在腸道不同細胞中表達，對細菌、病毒和真菌的各種成分有明確的特異性，其中最有特色的成員是TLR4。TLR4是革蘭陰性菌表明的脂多糖(LPS)的受體，在健康腸道中低表達，與細菌LPS結(jié)合后引起的細胞反應(yīng)極低，從而降低由腸道共生菌引起的局部炎性反應(yīng)[4]。動物研究表明，TLR的表達在大鼠出生后受到抑制，從而利于腸道菌群的建立。給大鼠胎兒或新生大鼠口服LPS有高致死率，而1月齡的大鼠對大劑量的LPS有更高的耐受力，在患NEC的人和小鼠中，腸道TLR4的水平顯著升高。TLR4突變型小鼠(C3H/HeJ)比野生型小鼠(C3HeB/FeJ)的NEC發(fā)病率明顯降低。白細胞介素-1(IL-1)受體相關(guān)激酶(IRAK)為TLR信號通路中的一員，經(jīng)IRAK抑制劑干預(yù)后，實驗動物NEC癥狀減輕，病理明顯改善，NEC發(fā)生率明顯降低[5]?；趧游镅芯拷Y(jié)論，研究者們利用候選基因法對極低出生體重兒的TLR4單核苷酸多態(tài)性(SNP)進行研究，發(fā)現(xiàn)與TLR4相關(guān)的SNP攜帶者與極低出生體重兒發(fā)生NEC的風(fēng)險無關(guān)，隨后的早產(chǎn)兒隊列研究中亦發(fā)現(xiàn)與TLR受體(TLR2、TLR4、TLR5和TLR9)、IRAK1相關(guān)的SNP與NEC沒有明顯關(guān)系[6]。但隨著對TLR基因更深入的認識，最近的研究發(fā)現(xiàn)攜帶有TLR4信號通路的另一個受體——髓樣分子-2(MD2)變異(RS11465996)的嬰兒發(fā)生需要外科手術(shù)治療的NEC的風(fēng)險明顯升高[7]。TLR相關(guān)基因突變主要影響TLR及其受體的表達，動物研究發(fā)現(xiàn)TLR突變顯著影響NEC的發(fā)病，但在早產(chǎn)兒研究中發(fā)現(xiàn)TLR受體相關(guān)的SNP與NEC發(fā)病無明顯關(guān)系，可能是因為這些研究依賴于目前已知的基因變異，而與NEC發(fā)病相關(guān)的TLR突變還未被發(fā)現(xiàn)，且目前研究樣本量均較小，需要更深入及大樣本量的研究加以驗證和解釋，MD2變異嬰兒發(fā)生需要外科手術(shù)治療的NEC風(fēng)險明顯升高，但其機制目前尚不清楚，有待進一步研究。

1.2TLR負調(diào)節(jié)因子突變 單個免疫球蛋白IL-1受體相關(guān)分子(SIGIRR)是IL-1和TLR信號的負調(diào)節(jié)因子，可抑制TLR活化、增強腸道對細菌的免疫耐受，腸道SIGIRR的丟失可能導(dǎo)致病原體介導(dǎo)的TLR4過度激活，從而導(dǎo)致NEC的發(fā)生，利用全外顯子測序和Sanger測序相結(jié)合對18例NEC早產(chǎn)兒的SIGIRR編碼區(qū)進行測序，發(fā)現(xiàn)11例均有錯義突變，其中的先證者一對雙胞胎同時具有相同的終止突變(p.Y168X)和罕見的錯義突變(p.S80Y)，而在20例無NEC的早產(chǎn)兒中沒有發(fā)現(xiàn)相同的突變[8]。動物研究發(fā)現(xiàn)，利用低氧、喂養(yǎng)配方奶、LPS給藥誘導(dǎo)SIGIRR-/-和SIGIRR+/+的小鼠發(fā)生實驗性NEC，SIGIRR-/-小鼠的腸道炎癥因子的表達明顯更高，腸道損傷程度更嚴重，且與TLR通路的激活有關(guān)，表明新生腸道中SIGIRR的丟失會導(dǎo)致腸道炎癥加劇和NEC易感性增加[9]。盡管沒有直接證據(jù)表明TLR基因突變與NEC發(fā)病相關(guān)，但是TLR的負調(diào)節(jié)因子SIGIRR可能是有前途的NEC候選基因。

1.3NOD2變異 NOD2是一種與先天免疫相關(guān)的細胞內(nèi)PRR，能抵抗病原體入侵，促進細胞凋亡，誘導(dǎo)細胞因子和炎癥因子的產(chǎn)生，NOD2功能多態(tài)性與腸道炎癥性疾病密切相關(guān)。動物實驗發(fā)現(xiàn)NOD2通過抑制TLR4的激活減輕腸道細胞的損傷，從而減輕NEC的嚴重程度，故NOD2可能與SIGIRR類似，均通過抑制TLR影響NEC的發(fā)病[10]。既往研究對小樣本早產(chǎn)NEC患兒進行NOD2基因測序，未發(fā)現(xiàn)NOD1和NOD2的變異與NEC發(fā)病相關(guān)，這可能與樣本量小，NOD2基因突變率低有關(guān)。最近一項納入了9 000多例歐洲極低出生體重兒的基因分型研究中發(fā)現(xiàn)存在兩個或多個NOD2功能缺失的嬰兒需要手術(shù)治療的NEC風(fēng)險顯著增加[11]，這可能與NOD2功能缺失對TLR4的抑制作用減弱有關(guān)，使NOD2功能缺失的基因變異可能會增加NEC的嚴重程度，使NOD2功能增強的基因變異是否會減輕NEC嚴重程度目前尚少見相關(guān)研究報道。

1.4MBL突變 MBL是一種循環(huán)模式識別分子，通過識別入侵病原體的特殊碳水化合物成分激活補體系統(tǒng)誘導(dǎo)其吞噬作用清除病原體，MBL水平的改變與感染、早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育不良、炎癥性腸病和NEC相關(guān)。最初的研究對早產(chǎn)兒MBL-2基因第一外顯子基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)MBL-2基因第54位和57位突變者發(fā)生敗血癥、動脈導(dǎo)管未閉的風(fēng)險明顯高于野生型，而與NEC無關(guān)[12]。隨后一項納入了107例胎齡<32周的早產(chǎn)兒(NEC 41例)的研究中，研究者通過檢測MBL-2基因型、血清MBL水平及NEC手術(shù)者腸組織MBL表達水平，發(fā)現(xiàn)MBL-2基因54位和57位密碼子突變與NEC無關(guān)，而在啟動子(-221 X/Y)的單核苷酸多態(tài)性與NEC發(fā)病明顯相關(guān)，且NEC患兒血清MBL水平明顯升高，嚴重NEC中MBL-2基因及腸組織中MBL表達水平更高[13]，另外的研究亦發(fā)現(xiàn)MBL-2突變型(第54/57/52位密碼子突變)患兒血清MBL水平明顯低于野生型，NEC患兒的患病率低[14]。血清MBL是循環(huán)模式識別分子，可以通過識別TLR-2/6/4而調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生[15]，MBL-2基因不同位點的變異對血清MBL水平有不同的影響，目前研究表明血清MBL水平與NEC發(fā)病率及嚴重程度呈正相關(guān)。

2 其他基因變異

2.1自噬相關(guān)基因(ATG16L1)突變 ATG16L1位于2q37.1染色體上，編碼蛋白質(zhì)Atg16L，參與形成自噬體，自噬體對于組成吞噬病原體的溶酶體至關(guān)重要，研究表明ATG16L1突變與腸道炎癥性疾病如克羅恩病密切相關(guān)，在NEC發(fā)病過程中，ATG16L1誘導(dǎo)的自噬使NEC的腸道損傷更嚴重，而ATG16L1的減少可以降低NEC的發(fā)病率[16]。通過對NEC與非NEC早產(chǎn)兒的ATG16L1基因進行分型發(fā)現(xiàn)其突變體——Thr300Ala與低NEC發(fā)病率相關(guān)，這可能是因為該突變增加了ATG16L1對caspase-3介導(dǎo)的降解反應(yīng)的敏感性，導(dǎo)致自噬減少，從而降低NEC的發(fā)病率。同時，該項研究復(fù)制的獨立隊列研究(260例嬰兒，23例NEC患兒)也表明ATG16L1不同基因型間NEC發(fā)病率有明顯差異，這為該基因在NEC中的重要性提供了進一步的證據(jù)[17]。目前研究表明ATGL1基因的突變可能通過影響Atg16L蛋白的水平，從而影響自噬體的形成，進而影響NEC的發(fā)病及嚴重程度，但ATGL1不同基因突變與NEC發(fā)病的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

2.2核因子κB(NF-κB)基因突變 NF-κB是主要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)TLR、NOD和IL途徑，抑制NF-κB可以減輕缺血缺氧所致的腸道損傷，NF-κB受抑制蛋白(IκB)調(diào)節(jié)，該蛋白與細胞質(zhì)中的NF-κB結(jié)合，阻止其進入細胞核而抑制炎癥基因的表達，未成熟腸上皮細胞的IκB水平較低，導(dǎo)致對NF-κB抑制作用降低。通過動物研究中檢測圍產(chǎn)期大鼠和新生NEC大鼠模型的NF-κB活性程度，研究者發(fā)現(xiàn)大鼠腸道NF-κB在出生時就被強烈激活，喂養(yǎng)母乳的新生大鼠在1 d內(nèi)下調(diào)，受到缺氧等應(yīng)激因素影響的大鼠第2天仍保持較高活性，并且內(nèi)源性NF-κB抑制蛋白IκB水平顯著降低，表明NF-κB過度激活促進了NEC的發(fā)展，藥物實驗發(fā)現(xiàn)給予大鼠抑制NF-κB活性的藥物能降低腸道損傷程度[18]。分別對NEC與非NEC患兒進行基因檢測發(fā)現(xiàn)，在所有NEC患兒中均存在NF-κB1(g.-24519delATTG)變異，而非NEC患兒中僅占65%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，相反，NF-κB1抑制基因——NF-κBIA(g.-1004A>G)變異在NEC患兒中的檢出率為13.3%，而在非NEC患兒中的檢出率明顯升高達49%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[6]。在NEC發(fā)病過程中，NF-κB進入細胞核介導(dǎo)炎癥通路的表達，使NF-κB表達增強的基因變異可能是NEC發(fā)病的必要因素，而NF-κB1抑制基因表達增強的變異對NEC具有保護作用。

2.3血小板活化因子(PAF)基因突變 PAF是有促炎作用的內(nèi)源性磷脂，活化后可導(dǎo)致白細胞和血小板聚集、上皮細胞損傷、凋亡、血管收縮及腸道黏膜通透性增加、緊密連接受損，在NEC致病過程中起著重要作用。在循環(huán)中PAF可被PAF乙酰水解酶(PAFAH)降解。動物實驗發(fā)現(xiàn)給大鼠輸注PAF能使其發(fā)生腸壞死，而腸內(nèi)注射PAFAH可以使NEC發(fā)病率顯著降低[19]。母乳中含有大量的PAFAH，而且早產(chǎn)兒母乳中PAFAH活性持續(xù)的時間更長。研究發(fā)現(xiàn)敲除了PAFAH基因的幼鼠在生后早期發(fā)生與細菌感染和窒息相關(guān)的死亡率降低，但后期發(fā)生NEC的概率明顯升高，基于這些研究，一項對570名早產(chǎn)兒(Ⅰ期或Ⅱ期NEC 36例)的PAFAH基因變異進行檢測，發(fā)現(xiàn)NEC與非NEC患兒中PAFAH基因變異率沒有顯著差異。但這項研究將Ⅰ期和Ⅱ期NEC均納入實驗組，且NEC組樣本量小，另一項國內(nèi)研究評估了使PAF失活的另一個拮抗劑——高爾基體α-甘露糖苷酶2激活蛋白(GM2AP)的單核苷酸多態(tài)性，納入了125例嬰兒，其中NEC 42例，發(fā)現(xiàn)NEC發(fā)病與GM2AP的2個變體rs1048719、rs2075783存在正相關(guān)[7]。然而，該項研究中沒有區(qū)分足月兒和早產(chǎn)兒，難以確認檢測到的差異是由于早產(chǎn)還是NEC。動物實驗表明PAF相關(guān)基因與NEC發(fā)病密切相關(guān)，但PAF相關(guān)基因在人類疾病中的作用及其突變與NEC的關(guān)系尚需進一步研究。

2.4凝血相關(guān)基因突變 NEC中常見凝血障礙和腸系膜血栓形成，抑制凝血酶可以減輕NEC的腸道損傷[20]，研究者測定了NEC患兒與同體重和胎齡的健康組和敗血癥組的凝血相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)NEC組12個凝血和抗凝相關(guān)基因發(fā)生了顯著改變[21]。

2.5生長因子相關(guān)基因突變

2.5.1血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)相關(guān)基因 腸道缺血是NEC發(fā)病的危險因素，NEC的組織學(xué)特征是腸道全層缺血凝固性壞死，最近的研究表明腸黏膜微血管系統(tǒng)發(fā)育不良在NEC發(fā)病中起重要作用。而正常VEGF信號傳導(dǎo)過程對于微血管的發(fā)育和維持及缺血后的血管恢復(fù)是必不可少的。VEGF家族成員中VEGFA是血管生成的關(guān)鍵因子，與內(nèi)皮細胞的血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)結(jié)合，從而促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移、分化和血管形成[22]。研究發(fā)現(xiàn)VEGF及VEGFR2在出生前3 d的腸道中高表達，在生后顯著降低[23]。上調(diào)小鼠腸上皮細胞VEGF的表達，促進內(nèi)皮細胞增殖，對腸道具有保護作用。反之在實驗NEC鼠中，利用VEGFR2特異性激酶抑制劑處理新生小鼠幼崽，小鼠腸道壞死程度更嚴重，死亡率更高[24]。

最初的研究評估了NEC中的VEGF多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)攜帶有VEGF-2578等位基因突變傾向于降低VEGF的產(chǎn)生，與NEC發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)[25]。一項在中國漢族人群中的研究亦發(fā)現(xiàn)在VEGFA的單核苷酸多態(tài)性中，rs699947和rs833061與血漿低VEGFA水平與高NEC發(fā)病率顯著相關(guān)[26]。而國外研究發(fā)現(xiàn)VEGFC-2578A的SNP中rs699947與NEC發(fā)病沒有明顯相關(guān)性，可能與不同種族人群基因變異率不同有關(guān)[27]。

2.5.2肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)基因 HB-EGF對實驗性NEC的腸道具有保護作用[28]。研究者檢測了30例早產(chǎn)NEC患兒和80例對照組患兒的5個HB-EGF SNP及其血漿水平，發(fā)現(xiàn)NEC患兒血漿HB-EGF水平降低，rs4912811遺傳變異與低血漿HB-EGF水平和高NEC風(fēng)險相關(guān)[29]。

2.6炎癥因子相關(guān)基因突變 發(fā)生NEC的早產(chǎn)兒血漿和腸道組織中炎性細胞因子的水平升高，表明炎性細胞因子在NEC發(fā)展過程中可能發(fā)揮了促進作用。研究發(fā)現(xiàn)NEC患兒中TLR4、NF-κB、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α、IL-6、IL-10表達上調(diào)[30]。但是，尚不清楚這種增加的細胞因子是NEC的促進因素還是對NEC發(fā)生的反應(yīng)。已有研究檢測了細胞因子基因多態(tài)性與NEC的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α和IL-1β、IL-4受體α鏈、IL-6、IL-18和IL-10的功能變異與NEC無明顯關(guān)聯(lián)[31]。一項更大樣本量的研究發(fā)現(xiàn)高加索新生兒IL-6(rs1800795)變異體與NEC呈正相關(guān)，在這項研究中納入的均為Bell Ⅱ期以上的NEC早產(chǎn)兒，對NEC的定義更精確，這可能是得出不同結(jié)論的原因。因此，需要更大樣本量更嚴格的研究來驗證這一發(fā)現(xiàn)。另一方面，在炎癥信號通路的抑制途徑中發(fā)現(xiàn)雙重特異性磷酸酶(DUSPs)基因變異與嚴重NEC相關(guān)。DUSP是促分裂原激活的蛋白激酶，能抑制炎癥信號通路。研究發(fā)現(xiàn)DUSP-6基因rs704074變異發(fā)生需要外科手術(shù)的NEC風(fēng)險明顯降低[32]。

2.7氧化應(yīng)激相關(guān)基因變異 腸道缺血再灌注損傷會產(chǎn)生活性氧(ROS)。ROS是細胞功能的重要介質(zhì)，被抗氧化劑系統(tǒng)中和，成熟腸道中自由基和抗氧化劑之間存在微妙的平衡。而早產(chǎn)兒抗氧化酶水平和活性相對缺乏，當ROS的產(chǎn)生超過抗氧化能力，或當抗氧化系統(tǒng)缺陷時，就會發(fā)生氧化應(yīng)激(OS)，OS對組織和細胞均有損傷，包括膜脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的改變及DNA損傷，導(dǎo)致腸道的損傷和炎癥形成。OS水平與NEC的發(fā)病及嚴重程度相關(guān)，腸內(nèi)喂養(yǎng)時，新生兒腸上皮細胞清除ROS的能力降低也會促進NEC的發(fā)生，因此推測抗氧化劑基因的功能性SNP影響早產(chǎn)兒NEC的發(fā)病風(fēng)險。通過對比早產(chǎn)兒NEC和自發(fā)性腸穿孔全基因組差異，發(fā)現(xiàn)在NEC中OS基因表達發(fā)生了顯著變化[33]，基于這些研究，HUIZING等[34]進行了候選基因關(guān)聯(lián)的初步研究，發(fā)現(xiàn)在早產(chǎn)兒NEC與非NEC組中已知的6個抗氧化基因[NFE2L2 (Rs6721961)、SOD2 (Rs4880)、GSTP1 (Rs1695)、NQO1 (Rs1800566)、GCLC (Rs17883901)和Hmox1 (Rs2071747)]的功能SNP沒有明顯差異，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)與OS相關(guān)的另一個基因——編碼細胞色素B-245α鏈(CYBA)的C242T多態(tài)性與NEC發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。目前，OS基因與NEC發(fā)病的研究主要依靠候選基因法，研究結(jié)論受到人們對基因認識水平的限制。

3 結(jié) 語

與NEC相關(guān)的遺傳因素研究目前主要集中在調(diào)節(jié)PRR表達及相關(guān)信號通路的細胞因子表達水平上，主要采取的方法為候選基因法，評估一些可能與NEC發(fā)病相關(guān)的基因變異，然后選擇NEC患兒與非NEC患兒進行對照研究，因此研究結(jié)論受到NEC診斷分型標準、樣本量、不同種族人群遺傳差異及對基因功能認識程度等因素影響，亦有研究者對早產(chǎn)兒進行了全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)了多個與NEC顯著相關(guān)的基因變異，但這些基因的意義及導(dǎo)致NEC發(fā)病的機制仍有待進一步研究。未來的研究應(yīng)在嚴格控制納入標準，充分考慮NEC診斷分型、種族來源等影響因素的基礎(chǔ)上進行更大樣本量更深入的研究，進一步探討遺傳因素與NEC發(fā)生的機制，期望未來能通過遺傳因素預(yù)測NEC的發(fā)生及嚴重程度，進行早期預(yù)防、早期診斷并能進行更加有針對性的治療，從而降低NEC的發(fā)病率和死亡率，改善NEC患兒的預(yù)后。