酶法制備魚降血壓肽的工藝優(yōu)化及其組分分析

徐 倩,戴 遙,趙永慧,蓋樂樂,劉曉攀,張中堂,王 熙,王祥鵬,盤賽昆,3,4,*

(1.淮海工學院 海洋生命與水產(chǎn)學院,江蘇連云港 222005; 2. 江蘇天邊漁村食品有限公司,江蘇連云港 222100; 3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心淮海工學院,江蘇連云港 222005; 4.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇連云港 222005)

高血壓是最常見的心血管疾病,是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題[1]。調(diào)查結(jié)果顯示,我國18歲及以上居民高血壓患病率為18.8%,估計全國患病人數(shù)超過1.6億,高血壓已成為嚴重威脅我國居民健康的主要疾病[2]。因此,開發(fā)降血壓藥物具有重要的現(xiàn)實意義。目前,治療高血壓最常見的方法是服用化學合成的降壓藥物,但長期服用會引發(fā)一系列的副作用:如氣管痙攣、心悸、味覺功能紊亂、皮膚過敏等[3],因而非化學合成藥物的輔助降壓更受到患者的青睞,其中利用天然蛋白質(zhì)制備的降血壓肽由于安全性高、無毒副作用已成為降血壓研究領(lǐng)域的熱點[4]。

降血壓肽是目前研究最深入、最系統(tǒng)且潛在應用價值最高的一種生物功能性肽[5],可通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)活性,促進血管平滑肌進行舒張,血壓下降,使人體血壓處于穩(wěn)定狀態(tài)[6]。降血壓肽來源廣泛,可分為陸源蛋白肽和海洋生物蛋白肽兩種。目前,陸源蛋白肽中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多有潛力的降血壓肽,如蛋清蛋白降壓肽[7]、花生蛋白降壓肽[[8]、羊骨降壓肽[9]等。由于海洋生物種類和數(shù)量都遠大于陸源生物,所以國內(nèi)外的研究者對水產(chǎn)品蛋白降血壓肽進行了大量的研究,發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)來源的降血壓肽的效果優(yōu)于其他食品蛋白源的降血壓肽[10]。

鲬魚(Platycephalusindicus),俗稱狗腿魚,屬于暖水性底層魚類,分布于太平洋西部和印度洋,我國黃海與渤海產(chǎn)量較大,是我國重要的經(jīng)濟魚類之一[11]。鲬魚具有產(chǎn)量高、價格低、蛋白質(zhì)含量豐富的特點,是一類具有很大開發(fā)潛力的魚類資源[12]。近年來,由于市場對鲬魚的需求量不斷增加,鲬魚養(yǎng)殖業(yè)也逐漸形成沿海地區(qū)的新興支柱產(chǎn)業(yè)之一。目前鲬魚多為原料型初級產(chǎn)品,且國內(nèi)外學者對鲬魚的研究大多集中在生物學方面,對其生理活性物質(zhì)中的真正有效成分的研究較少[13]。本研究以新鮮鲬魚為原料,通過蛋白質(zhì)酶解技術(shù)[14]制備生物活性肽[15],為鲬魚的深加工和綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鲬魚 體長約380 mm±50 mm,體寬約80 mm±10 mm,蛋白質(zhì)的含量為18.53%,購于連云港市水產(chǎn)品直銷市場;酪氨酸 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;干酪素 化學純,國藥集團化學試劑有限公司;Alcalase(89767 U/g)、木瓜蛋白酶(617400 U/g)、酸性蛋白酶(91570 U/g) 諾維信生物技術(shù)有限公司;馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(色譜級)Sigma公司;其余試劑均為分析純。

DK20消化系統(tǒng)、UDK132半自動蒸餾系統(tǒng) 意大利VELP公司;UV754N-紫外可見分光光度計 上海市精科有限公司;CR22G高速冷凍離心機 日本HITACHI公司;JMS-50膠體磨 廊坊市正瑞機械有限公司;DS-1高速組織搗碎機 金壇市榮華儀器制造有限公司;Biologic DuoFlowRR蛋白質(zhì)層析系統(tǒng) 美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 新鮮鲬魚→去頭、去鰭、去內(nèi)臟→清水沖洗干凈→切段→絞碎(5000 r/min,8 min)→分裝(50 g/袋)→-18 ℃冷凍保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 鲬魚活性肽的制備 原料→解凍→調(diào)節(jié)固液比→勻漿→調(diào)節(jié)pH→酶解→滅酶(沸水浴,15 min)→冷卻→離心(3000 r/min,10 min)→取上清液→鲬魚降壓肽

1.2.3 酶的選擇 選擇具有代表性的三種酶按表1在最適反應條件下酶解鲬魚,加酶量均為2000 U/g·pro,根據(jù)水解進程確定適宜的酶。供試酶的活力分別為Alcalase 89767 U/g·pro,酸性蛋白酶91570 U/g·pro,木瓜蛋白酶617400 U/g·pro。

表1 供試蛋白酶作用條件Table 1 Hydrolysis conditions of tested proteinase

1.2.4 水解度的測定 總氮采用凱氏定氮法參照文獻[19]的方法測定,氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法參照文獻[20]的方法測定,計算水解度公式:

式中:V1為用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL);V2為用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL);c為氫氧化鈉標準溶液濃度(mol/L);n為勻漿的固液比(g/mL);s為魚肉總氮(mg);0.014為1/2N2的毫摩爾質(zhì)量(g/mmol)。

1.2.5 肽含量測定 基于雙縮脲反應機理,參照文獻[21]的方法以谷胱甘肽為標準,測定鲬魚酶解液的肽含量。按表2加樣,在漩渦儀上混合均勻,靜置10 min,在540 nm處測定吸光值。以肽質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線;鲬魚水解液離心(3 ℃,10000 r/min,10 min),取上清液,加三氯乙酸(TCA),再進行低速離心(10 min,3000 r/min),取上清液,與雙縮脲以3∶2比例混合,靜置10 min,在540 nm處測定吸光值,根據(jù)標準曲線(y=0.1089x+0.0046)計算肽含量。

表2 谷胱甘肽標準曲線加樣表Table 2 Schedule of Glutathione standard curve

1.2.6 ACE抑制率的測定 體外ACE抑制活性的測定參照文獻[22]采用改進的分光光度法測定,按表3配制反應液。對照管吸光值記為A,樣品管吸光值記為S,空白管吸光值記為C,ACE抑制率計算公式:

表3 反應液加樣表Table 3 Schedule of the reaction liquid

1.2.7 酶解單因素實驗 影響酶解作用的因素一般為酶解時間、pH、溫度、加酶量、固液比等五個單因素。以ACE抑制率和水解度為指標,考察各因素對水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響。

1.2.7.1 反應溫度對蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響 固液比1∶5 g/mL,pH=8,加酶量為35000 U/g·pro,酶解時間2.5 h,溫度分別為40、50、60、70 ℃。

1.2.7.2 pH對蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響 固液比1∶5 g/mL,加酶量為35000 U/g·pro,溫度50 ℃,酶解時間2.5 h,pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0。

1.2.7.3 固液比對蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響 pH=8,加酶量為35000 U/g·pro,溫度50 ℃,酶解時間2.5 h,固液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 g/mL的懸浮液。

1.2.7.4 加酶量對蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響 固液比1∶5 g/mL,pH=8,溫度50 ℃,酶解時間2.5 h,加酶量分別為25000、30000、35000、40000 U/g·pro。

1.2.7.5 酶解時間對蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響 固液比1∶5 g/mL,pH=8,加酶量為35000 U/g·pro,溫度50 ℃,時間設(shè)置為1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.8 響應面優(yōu)化酶解條件 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇三個關(guān)鍵因素,按旋轉(zhuǎn)中心組合試驗設(shè)計原理設(shè)計試驗,因素水平見表4。

表4 響應面實驗因素水平表Table 4 Factors and levels of response surface analysis methodology

1.2.9 驗證實驗 通過響應面優(yōu)化得出最佳酶解條件,在最佳條件下制得酶解液,并測定其ACE抑制率,做三次平行實驗,并進行T檢驗,判斷是否具與預測值有顯著性差異。

1.2.11 分子量分布測定 利用凝膠層析法[24-25]測定酶解物的分子量分布,通過Sephadex G-15柱(φ1.1 cm×50 cm)進行分析檢測。以純水為洗脫液,流速為0.4 mL/min,上樣量為3.5 mL,QuadTecTM檢測器檢測,檢測波長為280 nm。標準樣分別為L-酪氨酸(Mr=181.19),AMP(Mr=347.2),輔酶I(NAD,Mr=681.44),短桿菌肽(Bacitracin zinc,Mr=1486.2),用緩沖液配成5 g/L的溶液備用,用藍葡聚糖2000測定柱外水體積Vo,然后由標準樣的保留時間乘以洗脫液流速計算出相應的洗脫體積Ve,并按下式計算Kav(有效分配系數(shù)),其中Vt為柱床總體積:

然后以相對分子質(zhì)量的對數(shù)值(logMr)為橫坐標,Kav為縱坐標繪制標準曲線。樣品的相對分子質(zhì)量根據(jù)其洗脫體積由標準曲線求得。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的篩選

采用Alcalase、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶水解鲬魚蛋白,進程如圖1～圖2。

圖1 不同蛋白酶對蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on degree of hydrolysis

圖2 不同蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制率Fig.2 ACE inhibitory ratio of different enzymatic hydrolysate

圖1顯示,供試蛋白酶作用于鲬魚蛋白后,在試驗時間范圍內(nèi),蛋白的水解度都隨著酶解時間的增加而增加。其中,酸性蛋白酶作用下水解度高于Alcalase和木瓜蛋白酶,其大約5 h可完成整個水解過程,最終水解度為34.45%。僅從水解度來看,3種酶中酸性蛋白酶最適合水解鲬魚蛋白。但圖2顯示,酸性蛋白酶水解物的ACE抑制率雖然比木瓜蛋白酶水解物強,但比Alcalase水解物的ACE抑制率弱。木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶的水解產(chǎn)物ACE抑制率隨水解進程的變化極為相似,在4.5 h時達到穩(wěn)定,但最終獲得的ACE抑制率較低。這可能是由于不同的酶具有各自的底物專一性,其酶切位點所作用的氨基酸種類不同,釋放的肽段長短不一,序列各異,對ACE的競爭性抑制強弱也不同。

綜上,以酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為主要參考指標,以水解度為輔助參考指標,發(fā)現(xiàn)Alcalase水解后的鲬魚酶解液的ACE的抑制活性最高,2.5 h后ACE抑制率即達到86.12%,顯著高于木瓜蛋白酶與酸性蛋白酶(p<0.05),所以選擇Alcalase酶作為最適宜水解酶。

2.2 單因素實驗

2.2.1 溫度對抑制率及水解度的影響 Alcalase分子穩(wěn)定性與酶解溫度的高低密切相關(guān)。反應溫度過高,酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,次級鍵解離,致使酶的活性降低甚至喪失催化活性。但反應溫度過低,體系內(nèi)分子運動速度緩慢,降低了酶與蛋白分子的碰撞幾率[26]。由圖3可知,溫度對鲬魚蛋白酶解產(chǎn)物的水解度和ACE抑制率的影響較大,而具有較好的相關(guān)性。在測定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,水解度和ACE抑制率呈先上升后下降趨勢,在50 ℃時二者均達到最大值:水解度為23.94%,ACE抑制率為84.55%。當溫度高于50 ℃時,可能因酶的活性受到抑制,所以水解度和ACE抑制率急劇下降,則表明Alcalase的活性受溫度影響顯著(p<0.05)。因此,Alcalase水解鲬魚蛋白適宜的溫度為50 ℃。

圖3 溫度對ACE抑制率影響折線圖 Fig.3 Temperature effect on the ACE inhibitory activity chart

2.2.2 pH對抑制率及水解度的影響 酶促反應中,酶活力受pH影響較大。根據(jù)圖4可以看出,pH在6.0～7.0范圍內(nèi),水解度和ACE抑制率隨pH迅速增加;繼續(xù)增大pH(7.0～8.0),水解度和ACE抑制率增加緩慢,表明酶促反應速率降低。當pH升高至8.0時,水解度和ACE抑制率分別達最大值:水解度為24.33%,ACE抑制率為84.35%。隨著pH進一步提高,水解度和ACE抑制率呈現(xiàn)明顯下降趨勢,主要原因為在過堿性環(huán)境中,酶的構(gòu)象發(fā)生改變,降低了酶的活性,由此表明Alcalase適合于弱堿性的環(huán)境。因此,Alcalase酶解鲬魚蛋白適宜的pH為8.0,此時獲得的產(chǎn)物活性也最高。

圖4 pH對ACE抑制率影響折線圖Fig.4 pH effect on the ACE inhibitory activity chart

2.2.3 固液比對抑制率及水解度的影響 由圖5可知,隨著固液比的不斷增大,即鲬魚蛋白濃度的降低,水解度不斷減小,表明試驗在選定的蛋白濃度范圍內(nèi),Alcalase酶解鲬魚蛋白中的底物肽鍵始終處于不飽和,在水解過程中,鲬魚蛋白濃度的降低,降低了水解的反應速度,從而導致水解度快速降低。然而,ACE抑制率隨著固液比的上升而下降,但幅度不大幾乎處于穩(wěn)定狀態(tài),表明固液比在Alcalase水解過程中對酶解產(chǎn)物的ACE抑制率影響較小。在固液比為1∶5 g/mL時ACE抑制率最大為81.67%,故酶解鲬魚蛋白最適固液比為1∶5 g/mL。

圖5 固液比對ACE抑制率影響折線圖Fig.5 Solid-liquid ratio effect on the ACE inhibitory activity chart

2.2.4 加酶量對抑制率及水解度的影響 由圖6可知,Alcalase添加量在2000.0～3000.0 U/g·pro范圍內(nèi),鲬魚蛋白的水解度隨添加量增大快速提高;酶添加量在3000.0～3500.0 U/g·pro 范圍內(nèi),水解度增加緩慢;當添加量達到3500.0 U/g·pro時,水解度達到最大值18.54%。水解過程中,隨著添加量的增大,大分子鲬魚蛋白在較短時間內(nèi)被降解成為小分子多肽,多肽得率迅速增加,體系反應的初速度迅速增大。當添加量較大時,底物已被酶所飽和,酶的濃度不再是水解反應的限速因素。而且,進一步添加酶的用量降低了產(chǎn)物肽所占蛋白的比重,導致測定時水解度明顯降低。隨著加酶量的增加,ACE抑制率呈先上升后下降的趨勢,當加酶量為3500 U/g·pro時,ACE抑制率達最大值84.63%。因此,Alcalase水解鲬魚蛋白適宜的加酶量為3500U/g·pro。

圖6 加酶量對ACE抑制率影響折線圖Fig.6 Enzyme amount effect on the ACE inhibitory activity chart

2.2.5 時間對抑制率及水解度的影響 由圖7可見,酶解初期,酶解液的ACE 抑制率隨水解度的增加而增大;酶解后期,酶解液的ACE 抑制率隨水解度的增大而降低。Alcalase兼具內(nèi)切和外切特性,它能快速地將蛋白質(zhì)從分子內(nèi)部或一端切割成小分子多肽。ACE一般易于與短肽結(jié)合,且酶解產(chǎn)物的C-端氨基酸是與ACE活性部位結(jié)合的關(guān)鍵。當小肽的C-端氨基酸為環(huán)狀結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸或脯氨酸時,對ACE具有較強的抑制作用[27]。當酶解時間達到2.5 h時,酶解生成的小肽C-端氨基酸含有的芳香族氨基酸或脯氨酸較多,隨著酶解時間的延長,水解度加大,部分肽段進一步裂解,肽段的空間結(jié)構(gòu)和C-端氨基酸被破壞,從而使ACE 抑制活性降低。由此可見,以水解度為指標,酶解3.0 h得到的酶解產(chǎn)物并非是對ACE活性有最大抑制率的酶解產(chǎn)物。而在酶解2.5 h時,酶解液的ACE 抑制率達到最大值77.83%,此時水解度為24.34%。因此,Alcalase水解鲬魚蛋白適宜的酶解時間為2.5 h。

圖7 時間對ACE抑制率影響折線圖Fig.7 Time effect on the ACE inhibitory activity chart

2.3 響應面分析法優(yōu)化酶解條件

2.3.1 模型建立 由單因素試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在設(shè)定的因素范圍內(nèi),料液比和反應時間對水解度與抑制率影響不顯著,加酶量、溫度、pH對水解度與抑制率影響相對顯著。因此,以ACE抑制率為響應值,采用Central Composite實驗設(shè)計優(yōu)化Alcalase水解鲬魚蛋白最優(yōu)工藝參數(shù)。不同因素及水平組合條件下ACE抑制率見表5,模型方差分析見表6。

表5 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果 Table 5 Test design and results

采用Design-Expert 8.0.6軟件的非線性回歸二次多項式擬合實驗數(shù)據(jù),得到的預測模型為:

ACE抑制率=85.26-2.96A-0.24B+7.38C-5.40A2-17.53B2-4.68C2+2.70AB+2.80AC-4.76BC+11.74ABC

由表6方差分析結(jié)果可以看出,模型p<0.0001方差模型達到極顯著,失擬p=0.061>0.05,不顯著,因此二次模型成立。模型的一次項A(溫度)和C(加酶量)對響應值有顯著影響,而B(pH)對響應值無顯著影響,說明3個因素中,溫度和加酶量對結(jié)果的影響較大。由表6中p值可知,3個影響因素對ACE抑制率的影響主次為加酶量>溫度>pH。交互項(AB、AC、BC)和二次項(A2、B2、C2)對響應值有顯著影響(p<0.05),說明因素之間的交互作用對試驗結(jié)果產(chǎn)生重要影響。

表6 優(yōu)化后的模型方差分析表Table 6 The anova table of the model after optimization

2.3.2 ACE抑制率響應面直觀分析 響應面可以直觀地反映各因素及它們之間的的交互作用對響應值的影響。圖8～圖10為本實驗響應面分析立體圖,通過對三維立體圖的分析可以很直觀的判斷加酶量、溫度和pH三個影響因素間的互相作用。

圖8 加酶量與pH的交互作用對ACE抑制率的影響Fig.8 Effect of interaction between enzyme addition and pH value on ACE inhibition rate

圖9 加酶量與溫度的交互作用對ACE抑制率的影響Fig.9 Effect of interaction between enzyme addition and temperature on ACE inhibition rate

圖10 pH與溫度的交互作用對ACE抑制率的影響Fig.10 Effect of interaction between pH value and temperature on ACE inhibition rate

如圖8所示,ACE抑制率隨pH和加酶量的增加而下降,響應曲面圖陡峭說明加酶量和pH之間交互作用極顯著,且加酶量上升幅度大于pH上升幅度,說明加酶量對ACE的抑制率的影響較大。由圖9可得,加酶量在整個因素水平內(nèi),ACE抑制率整體呈增長趨勢。溫度在整個因素水平的范圍內(nèi)對ACE的抑制率則是先增大后減小的,且整個過程變化平緩。加酶量上升幅度明顯大于提取溫度上升幅度,說明加酶量對ACE的抑制率的影響較大。由圖10可知,隨著pH和反應溫度的升高,ACE抑制率先升高后緩慢下降,pH和溫度兩者的交互作用對ACE的抑制率也有顯著影響。

根據(jù)該模型,得到的最優(yōu)解為A=48.94、B=7.93、C=32396.6,即最優(yōu)酶解條件是:溫度48.94 ℃,pH7.93,加酶量為32396.6 U/g·pro,固液比1∶5 g/mL,酶解時間2.5 h,在此條件下,模型預測值為88.94%。

2.4 響應面優(yōu)化結(jié)果驗證

根據(jù)設(shè)備精度將最優(yōu)的酶解條件擬修為溫度49 ℃、pH7.9、加酶量32396.6 U/g·pro、固液比1∶5 g/mL、酶解時間2.5 h,做三次平行試驗,測得ACE抑制率分別為:85.78%、81.34%、91.67%。使用SPSS進行T檢驗,由表7～表8可知,t=-0.892小于t(3,0.05)=3.182,可知p大于0.05,表明實測值與預測值無顯著差異,模型可靠。

表7 單個樣品統(tǒng)計量Table 7 A single sample statistic

表8 單個樣品檢驗Table 8 Single sample inspection

2.5 酶解物ACE抑制率IC50的測定

酶解物肽含量與ACE抑制率量效關(guān)系如圖11。

圖11 肽含量倒數(shù)與抑制率關(guān)系Fig.11 The relationship of content of peptides and ACE inhibition activity

在最優(yōu)酶解條件下制得具有較高的ACE抑制率的水解液,肽質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL。量效呈線性關(guān)系,用直線方程進行擬合(圖11)。根據(jù)量效關(guān)系模型計算得IC50=0.269 mg/mL。

2.6 分子量分布測定

測得Sephadex G-15柱的Vo為14.98 mL,Vt為47.50 mL,根據(jù)保留各標準物時間計算相應的Ve,各標準物保留時間與Ve分別為:L-酪氨酸保留時間為100.96 min,Ve是40.38 mL;AMP保留時間為80.76 min,Ve是32.30 mL;NAD保留時間為59.82 min,Ve是23.93 mL,;Bacitracin zinc保留時間為35.60 min,Ve是14.24 mL,進而求出有效分配系數(shù)Kav,制作標準曲線(圖13)。

圖12 SepHadex G-15柱標準物校準Fig.12 Standard curve of Standard material on SepHadex G-15

圖13 酶解物Sephadex G-15層析圖譜Fig.13 Chromatography of Hydrolysate of protein from Platycephalus indicus

如圖13所示,樣品經(jīng)過Sephadex G-15凝膠分離后得到3峰。峰1的保留時間為62 min,峰2的保留時間為90 min,峰3的保留時間為132 min,經(jīng)過計算得出峰1的相對分子質(zhì)量為635,峰2的相對分子質(zhì)量為258,峰3的相對分子質(zhì)量為67。測得1號峰ACE抑制率為64.56%,2號峰ACE抑制率為89.09%,3號峰ACE抑制率為60.76%,3個組分的肽含量分別為0.65、4.72、1.02 mg/mL,綜上表明活性組分是相對分子質(zhì)量較小的短肽和氨基酸。

3 結(jié)論

在對鲬魚進行酶解發(fā)現(xiàn),供試的酶中Alcalase適合水解鲬魚蛋白制備具有ACE抑制活性的水解產(chǎn)物;酶解的最佳條件為:溫度48.9 ℃,pH7.93,加酶量為32396.6 U/g·pro,酶解時間2.5 h,固液比1∶5 g/mL,在此條件下水解物的ACE抑制率IC50=0.296 mg/mL。酶解液由相對分子質(zhì)量為635、258和67的三種組分組成,其中相對分子質(zhì)量為258的組分是主要活性組分。