牦牛血抗氧化肽制備方法對比及分離純化研究

杜 昕， 李 誠*， 肖 嵐，， 劉愛平， 馮朝輝， 劉韞滔， 楊 勇， 范尹譯

（1.四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 625014；2.四川旅游學院 食品科學系，四川 成都610100）

關(guān)鍵字：牦牛血抗氧化肽；發(fā)酵；酶解；純化

牦牛[Yak]，偶蹄目，?？?，牛亞科，牦牛屬，生活在海拔3 km以上的缺氧高原，抗寒能力強[1]。我國牦牛資源豐富，飼養(yǎng)量占世界牦?？倲?shù)的90%以上，具有明顯的數(shù)量優(yōu)勢[2]。牦牛血中血紅蛋白含量較其他動物血液高，是十分寶貴的蛋白質(zhì)資源，然而在屠宰加工過程中被直接廢棄，既浪費資源又污染環(huán)境。近年來，人們發(fā)現(xiàn)水解動物屠宰血液得到的多肽具有較好的抗氧化活性[3-5]，且小分子肽具有無毒[6]、易吸收[7]、溶解性好等特點[8-9]，但關(guān)于利用牦牛血制備抗氧化肽的研究迄今為止未見報道。

目前，抗氧化肽的主要制備方法是發(fā)酵法和酶解法。酶解法制備抗氧化肽反應條件溫和、易于控制，安全性高，酶解反應具有高度的專一性，使抗氧化肽序列具有相似性[10]。嗜熱蛋白酶酶解乳白蛋白獲得5種抗氧化肽，肽序列末端至少含有一個Tyr或Trp殘基。木瓜蛋白酶主要酶解疏水性氨基酸與芳香族氨基酸[11]，但酶解法易產(chǎn)生苦味肽[12]；發(fā)酵法制備抗氧化肽，生產(chǎn)成本低，能有效解決酶解過程中產(chǎn)生苦味肽的問題，提高食物的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值[13-15]，但肽得率較低[16]；一些學者為改善單一酶解或發(fā)酵的不足，采用菌酶聯(lián)合方式制備抗氧肽，段旭昌等人[17]采用乳酸菌發(fā)酵甲魚酶解液，使其風味明顯改善并增加保健功能。王帥楠等人[18]利用酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)提高了豬骨泥鮮味氨基酸含量及抗氧化活性。然而，對于同種底物蛋白而言，尚未將3種不同制備方法進行比較，篩選出最適合該底物蛋白制備抗氧化活性肽的方法。此外，抗氧化肽的分離純化是生產(chǎn)抗氧化肽的關(guān)鍵步驟之一，如何將具有較高抗氧化活性的抗氧化肽從粗提液中分離出來，對其應用前景有重要意義。

本研究采用經(jīng)前期研究優(yōu)化后的枯草芽孢桿菌發(fā)酵法，堿性蛋白酶酶解法以及菌酶聯(lián)合法制備牦牛血抗氧化肽（BF、AP、BA）；選取 4種體外抗氧化活性實驗（·OH、·O2-清除能力、抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原力）綜合評價牦牛血抗氧化肽的抗氧化活性，篩選出牦牛血抗氧化肽的最佳制備方法；采用超濾、凝膠層析法對制備產(chǎn)物進行分離，以期獲得活性較高的牦牛血抗氧化肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛血：四川省大渡河食品有限公司；枯草芽孢桿菌SICC1.197：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；堿性蛋白酶（酶活力為85.61 U/mg）：上海Kayon公司；Sephadex G-25：BIORAD 公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

超濾管 （10 kDa、5 kDa）： 德國Sartorius公司；1.6×60 cm層析柱：北京索寶生物科技有限公司；WLB-78C型恒流泵：浙江新昌國康儀器廠；THZ-98AB恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；UV-3200紫外分光光度計：MAPADA；ULUP-IV-10T超純水裝置：西安優(yōu)普儀器設備有限公司；移液槍：Thermo；D37520 高速冷凍離心機：Thermo Fisher。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨 10，牛肉膏 10，氯化鈉 5，瓊脂 20，pH 7.0。種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 10，蛋白胨 10，牛肉膏 10，氯化鈉 5，pH 7.0。

1.3.3 堿性蛋白酶酶解牦牛血制備抗氧化肽 底物質(zhì)量濃度為75 g/mL牦牛血，加入堿性蛋白酶酶解，酶與底物比為 3 000 U/g，調(diào)節(jié)pH 9.5，60℃酶解 3 h，沸水浴 10 min滅酶，6 000 r/min離心15min，取上清液為抗氧化肽粗提液AP，測定其體外抗氧化活性。

1.3.4 菌酶聯(lián)合制備牦牛血抗氧化肽 采用菌酶分步聯(lián)合方式，按照1.3.2節(jié)方法進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)121℃、15 min高壓滅菌，冷卻后按照1.3.3節(jié)方法進行酶解（酶與底物比190 U/g），制備產(chǎn)物6 000 r/min離心15 min，取上清液為抗氧化肽粗提液BA，測定其體外抗氧化活性。

1.3.5 牦牛血抗氧化肽的分離純化

（1）超濾?？寡趸拇痔嵋航?jīng)0.45 μm濾膜過濾，去除菌體及殘渣；采用截留分子量為10 kDa、5 kDa的超濾離心管對膜過濾液進行分離（4 000 r/min，10 min），收集各超濾組分冷凍干燥，測定其對·OH 的 IC50。

（2）凝膠層析。對超濾組分中清除·OH能力最強的組分采用Sephadex G-25進行分離。以超純水為洗脫液，上樣量0.4 mL，洗脫流速0.2 mL/min。每10 min收集1管，收集到的樣品在214 nm下測定吸光值繪制出洗脫曲線，收集凝膠層析各峰組分冷凍干燥，測定其對·OH的IC50。

1.3.6 多肽含量的測定 參照陳昌琳等人[19]的方法，取4 mL待測樣品加入等體積15 g/L的三氯乙酸（TCA），混合均勻后靜置，待大分子蛋白沉淀，6 000 r/min離心15 min，采用Lowry法測定上清液蛋白質(zhì)含量，計為上清液中多肽含量。

1.3.7 體外抗氧化肽活性的測定

（1）3種制備產(chǎn)物的·OH清除率測定。試管中加入 1 mL 樣 品溶 液、1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37℃水浴30 min后，用紫外-可見分光光度計在510 nm波長下測定其吸光度。空白組用超純水代替樣品溶液。樣品·OH清除率計算公式為

術(shù)前積極進行各種原發(fā)病治療，采取貧血糾正措施，應用可吸收縫合線有助于降低外源性感染發(fā)生率，及時給予高燒不退患者抗感染治療，待患者病情好轉(zhuǎn)后及時將導尿管和氧氣管拔除以便于及早下地鍛煉[5] 。

其中，A0為空白組的吸光度；A1為實驗組的吸光度。

（2）3種制備產(chǎn)物的還原力的測定。將2 mL樣品溶液和2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液 （pH 6.6）混合，加入2.5 mL 1 g/L鐵氰化鉀溶液混合均勻，在50℃水浴20 min。再加入2 mL 15 g/L TCA溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液和1 mL蒸餾水混合，再加入0.5 mL的0.1 g/L FeCl3溶液，最后在700 nm下測量吸光度，吸光度越高說明樣品的還原能力越強。

（3）3種制備產(chǎn)物的·O2-清除率的測定。取5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）與 1 mL 樣液，置于25℃水浴預熱20 min，分別加入0.2 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，采取動力學法在325 nm處測定吸光值變化（每30 s測定一次吸光值，共計4 min），對照組以1 mL蒸餾水代替樣品測定吸光值變化，以Tris-HCl調(diào)零。樣品對超氧陰離子的清除率計算為其中，A1為對照組的吸光值變化斜率；A1為實驗組的吸光值變化斜率。

（4）3種制備產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化抑制能力的測定。取200 μL大豆卵磷脂溶液（20 mg卵磷脂，溶于5 mL 0.05 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液），和1 mL不同濃度的樣品溶液混合均勻，加入50 μL 50 mmol/L FeSO4，并以0.1 mmol/L pH 7.4磷酸緩沖液補足至體系總體積為3 mL，37℃水浴40 min，分別加入0.8 mL 15 g/L TCA和1 mL 0.8 g/L TBA，沸水浴15 min后冷卻，6 000 r/min離心10 min，取上清液用紫外-可見分光光度計在532 nm波長下測定其吸光度?？瞻捉M用磷酸緩沖液代替樣品溶液。

脂質(zhì)過氧化抑制率（%）=（1－A1/A0）×100%

其中，A0為空白組的吸光度；A1為實驗組的吸光度。

1.3.8 IC50值的測定 將樣品稀釋成不同質(zhì)量濃度（試驗點≥5），分別測定其還原力、脂質(zhì)過氧化抑制率及·OH、·O2-清除率。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標，測定值為縱坐標，繪制擬合曲線，從曲線中計算出IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種牦牛血抗氧化肽體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.1.1 還原力 牦牛血抗氧化肽的還原力如圖1所示，3種不同方法制備的抗氧化肽均具有還原能力，且吸光值與抗氧化肽濃度呈明顯的正相關(guān)性。隨著牦牛血抗氧化肽質(zhì)量濃度增加，吸光值增大，還原力越強，但增加速率不同。各質(zhì)量濃度下，BA的還原力大于BF大于AP；1～4 mg/mL范圍內(nèi)，BF、AP吸光值的增加速率幾乎相同；當質(zhì)量濃度大于4 mg/mL時，BF吸光值的增加速率減小。表1為3種抗氧化肽還原力的吸光值線性回歸結(jié)果。當A=0.5時，所需3種抗氧化肽質(zhì)量濃度差異顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果表明還原力大小為：BA＞BF＞AP。

圖1 牦牛血抗氧化肽的還原能力Fig.1 Activitiesofreducing power ofYak blood antioxidative peptides

表1 3種抗氧化肽還原力Table 1 Reduing power of three kinds of antioxidant peptides

2.1.2 脂質(zhì)過氧化抑制能力 圖2為3種牦牛血抗氧化肽抑制脂質(zhì)過氧化能力。脂質(zhì)過氧化抑制能力與抗氧化肽濃度呈明顯的正相關(guān)，隨著肽質(zhì)量濃度的增加，3種抗氧化肽脂質(zhì)過氧化抑制能力都增加；BA與AP的抑制率增加速率差別不大，均大于BF的抑制率增長速率；表2為3種抗氧化肽脂質(zhì)過氧化抑制能力的線性回歸結(jié)果。3種抗氧化肽脂質(zhì)過氧化抑制率的IC50差異顯著（P＜0.05），由此可知它們脂質(zhì)過氧化抑制能力大小為：BA＞AP＞BF。

2.1.3 ·OH清除能力 牦牛血抗氧化肽·OH清除能力如圖3所示，3種抗氧化肽均具有清除·OH的活性，且成明顯的劑量效應關(guān)系?！H清除率隨著抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加而增大，但是增加速率不同。各質(zhì)量濃度下，BF的·OH清除率均大于BA，AP；1～3 mg/mL濃度范圍內(nèi)，BF的清除率增加速率較大，當質(zhì)量濃度大于3 mg/mL時，清除率增加速率逐漸減小，此時·OH清除率大于95%；BA的·OH清除率，在低質(zhì)量濃度時較小，但清除率的增加速率較大，且保持穩(wěn)定，當質(zhì)量濃度達到5 mg/mL時，·OH清除率高達90%以上，接近BF的·OH清除率。AP的·OH清除率在1～3 mg/mL范圍內(nèi)極低，當質(zhì)量濃度大于3 mg/mL時，清除率的增長速率變大。3種抗氧化肽對·OH清除率的IC50如表3所示，差異顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，它們對·OH清除能力的大小為：BF＞BA＞AP。

圖2 牦牛血抗氧化肽的脂質(zhì)過氧化抑制能力Fig.2 Activities of lipid peroxidation inhibition of Yak blood antioxidative peptides

表2 3種抗氧化肽脂質(zhì)過氧化抑制率的IC50Table 2 Lipid peroxidation inhibition IC50values of three kinds of antioxidant peptides

圖3 牦牛血抗氧化肽的·OH清除能力Fig.3 Activities of scavenging hydroxyl radical of Yak blood antioxidative peptides

表3 3種抗氧化肽的清除·OH的IC50Table 3 Scavenging hydroxyl radical IC50values of three kinds of antioxidant peptides

圖4 牦牛血抗氧化肽的·O2-清除能力Fig.4 Activities of scavenging superoxide anion of Yak blood antioxidative peptides

表4 3種抗氧化肽清除·O2-的IC50Table 4 Scavenging superoxide anion IC50values of three kinds of antioxidant peptides

2.2 牦牛血抗氧化肽的分離純化結(jié)果

2.2.1 超濾對牦牛血抗氧化肽的純化結(jié)果 牦牛血抗氧化肽粗提液經(jīng)10 kD、5 kD超濾離心管超濾分級后，各組分活性測定結(jié)果如表5所示。

由表5可知，不同的分子量的肽段都具有清除·OH的能力，分子量大于10 kD的肽段與分子量介于于5～10 kD的肽段對·OH的IC50值差異不明顯；分子量小于5 kD的肽段對·OH的IC50值為1.62 mg/mL，說明高活性的牦牛血抗氧化肽分子量集中在5 kD以下，故收集此組分進行凝膠層析。

表5 不同分子量抗氧化肽對·OH的IC50值Table 5 Scavenging hydroxyl radical IC50values of antioxidative peptides in different molecular weight

2.2.2 凝膠層析對牦牛血抗氧化肽的純化結(jié)果對超濾分離所得＜5 kD組分進行Sephadex G-25凝膠層析，洗脫曲線如圖5所示。

由圖5可知，Sephadex G-25能較好地分離牦牛血抗氧化肽得到4個完全分離的峰，組分Ⅰ范圍是38～45管，組分Ⅱ是49～57管，組分Ⅲ是58～64管，組分Ⅳ是71～80管。收集并測定各組分抗氧化肽對·OH的IC50值。如圖6所示，組分Ⅰ對·OH清除率最高，其IC50值為0.72 mg/mL。而超濾后＜5 kD的組分IC50值為1.62 mg/mL，IC50的值下降，說明清除一半·OH活性需要的抗氧化肽質(zhì)量濃度下降，·OH清除能力提高，抗氧化肽得到進一步純化。所以，凝膠層析在超濾分級的基礎上進一步純化了抗氧化肽。

圖5 凝膠層析色譜圖Fig.5 Gel chromatography chromatography

圖6 各組分的對·OH的IC50值Fig.6 Scavenging hydroxyl radical IC50values of each component

3 討論

本實驗中酶解法、發(fā)酵法以及菌酶聯(lián)合法都能夠制備具有一定抗氧化活性的牦牛血抗氧化肽，與王忠合等人[20]、侯銀臣等人[21]研究結(jié)果一致，表明制備抗氧化肽方法具有一定相似性。菌酶聯(lián)合制備法得到的抗氧化肽對·OH、·清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力以及還原能力較單一酶解產(chǎn)物分別提高51.2%、48.47%、29.72%、46.86%，較單一發(fā)酵產(chǎn)物分別提高-52.08%、26.13%、58.41%、29.72%。與王帥楠等人[18]利用酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)提高豬骨的抗氧化功能性結(jié)果保持一致：酶解-發(fā)酵樣品與單一酶解樣品相比，對·OH、·清除能力、還原能力分別提高 73.23%、45.32%、164.23%，相比復合酶[22]、超聲輔助[23]等方法優(yōu)化制備抗氧化肽工藝，菌酶聯(lián)合方式更加顯著提高了樣品抗氧化活性。然而菌酶聯(lián)合法制備的牦牛血抗氧化肽對·OH清除能力弱于單一發(fā)酵法制得的產(chǎn)物，可能是由于蛋白酶的酶解具有選擇性，堿性蛋白酶酶解得到的多肽對羥基自由基的清除作用較弱，但對其他自由基具有較好的清除作用。如姜莉等人[24]采用堿性蛋白酶制備魔芋粉抗氧化肽，清除·OH的IC50為9.03 mg/mL，清除DPPH的IC50為2.82 mg/mL。其次，體外測定抗氧化活性的方法是基于不同抗氧化劑對自由基清除作用、Fe3+還原作用、螯合金屬離子能力或是對氧化自由基形成的抑制作用來分析其抗氧化能力的高低，由于抗氧化劑結(jié)構(gòu)差異，往往導致其在不同檢測體系中所反映出來的抗氧化能力具有明顯差異[25-26]，故本實驗選取4種體外抗氧化活性測定綜合評價抗氧化肽的抗氧化能力。

超濾與凝膠層析法都是根據(jù)多肽的分子量大小進行分離純化。丁順杰等人[27]超濾得到分子量為200～3 000 kD的繅蠶蛹蛋白抗氧化肽具有較高抗氧化活性。劉旺旺等人[28]超濾得到分子量3～10 kD的羊胎盤多肽抗氧化活性高于分子量＜3 kD的多肽。本實驗得到分子量小于5 kD的牦牛血抗氧化肽具有最高的抗氧化活性，且經(jīng)過Sephadex G-25層析后得到4個組分，其中組分Ⅰ抗氧化活性最高，說明抗氧化肽活性與其分子量有一定關(guān)系，但并非分子量越小，抗氧化活性越高，抗氧化活性還應與原料蛋白特點及酶切位點等有關(guān)[29]。

4 結(jié)語

以牦牛血為原料，采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵牦牛血，堿性蛋白酶酶解牦牛血以及菌酶聯(lián)合法制備3種牦牛血抗氧化肽。通過考察3種抗氧化肽體外抗氧化活性，菌酶聯(lián)合法是制備牦牛血抗氧化肽的最佳制備方法，其制備的抗氧化肽清除·O2-能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力以及還原能力最強；菌酶聯(lián)合制備牦牛血抗氧化肽粗提液經(jīng)超濾得到不同分子量范圍的抗氧化肽，其中分子量＜5 kDa的抗氧化肽的·OH清除能力高于分子量＞10 kD、介于5～10 kD的抗氧化肽；分子量＜5 kD的組分經(jīng)過Sephadex G-25層析柱后得到4個洗脫峰，其中峰Ⅰ組分的·OH清除能力最強且高于分離前組分活性。