不同黃酮類物質(zhì)對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響*

王靜靜 董 艷 肖靖秀 湯 利 鄭 毅,2

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南省教育廳，云南 昆明 650223)

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式中氮肥對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量效果十分顯著，我國(guó)已經(jīng)成為世界最大的化肥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1]，其中過量施用氮肥，既嚴(yán)重浪費(fèi)資源也影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、污染土壤、水體、大氣生態(tài)環(huán)境并降低生物多樣性[2]。豆科作物能夠與根瘤菌形成根瘤,將大氣中的氮固定為有機(jī)氮，從而減少化學(xué)氮肥，有利于減輕水土污染，提高土壤生物多樣性等[3-4]。因此，在高生產(chǎn)力條件下充分挖掘豆科植物生物固氮的潛力，對(duì)可持續(xù)的糧食生產(chǎn)體系具有重要作用。

黃酮類物質(zhì)是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)植物與環(huán)境之間的相互作用方面具有重要作用[5]。根系分泌物中的黃酮類物質(zhì)作為結(jié)瘤的初始信號(hào)，主要是通過根系分泌物向土壤環(huán)境釋放并被根瘤菌感知，在豆科作物結(jié)瘤過程中具有關(guān)鍵作用[6-8]。Novak等[9]人將柚皮素、橙皮素和槲皮素分別加入到豌豆 (Pisumsativum) 的培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)高濃度 (10～100 μg/mL) 促進(jìn)了豌豆根毛的卷曲變形，即早期的結(jié)瘤響應(yīng)。Li等[10]研究亦發(fā)現(xiàn)，外源添加槲皮素黃酮和毛地黃黃酮均對(duì)蠶豆結(jié)瘤具有顯著促進(jìn)效應(yīng)，分別比對(duì)照增加蠶豆根瘤干重95%和160%。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆 (Glycinemax)、苜蓿 (MedicagoSativa)、豌豆和木豆 (Cajanuscajan) 等豆科植物根系分泌結(jié)瘤信號(hào)物質(zhì)已經(jīng)開展了大量研究，在這些豆科作物根系分泌物中均發(fā)現(xiàn)了柑桔素、圣草酚、芹菜素、毛地黃黃酮、槲皮黃酮等黃酮類物質(zhì)[11]，而有關(guān)蠶豆根系分泌物中黃酮類分泌物的種類研究不多。蠶豆 (Viciafaba) 是世界上重要的豆科作物之一，具有較強(qiáng)的根際酸化能力，可以利用固氮根瘤菌形成根瘤并固定土壤中的氮[12-14]。因其具有糧食、蔬菜、飼料和綠肥兼用等特點(diǎn)，適應(yīng)性廣，具有較高的固氮量，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。為此，本實(shí)驗(yàn)以蠶豆根瘤菌為研究對(duì)象，探討不同黃酮類物質(zhì)對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響，并分析不同濃度的黃酮類物質(zhì)對(duì)根瘤菌數(shù)量、吸光度及菌落生長(zhǎng)的影響，旨在為豆科作物的結(jié)瘤固氮，節(jié)肥增產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試蠶豆根瘤菌菌種為Mesorhizobiumhuakuii93 (Mh 93)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所提供。黃酮類物質(zhì) (柚皮素、橙皮素、槲皮素、染料木素) 均為標(biāo)準(zhǔn)品，由德國(guó)西格瑪公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2017年9—10月在西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家高原濕地研究中心進(jìn)行，西南林業(yè)大學(xué)位于云南省中東部，氣候?qū)賮啛釒Ц咴撅L(fēng)氣候，多年平均氣溫為16.5 ℃，全年日照2 088.6 h，年均降雨量1 045.1 mm，年均蒸發(fā)量2 099.7 mm。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取4種黃酮物質(zhì) (即橙皮素、柚皮素、槲皮素、染料木素)，每種黃酮物質(zhì)設(shè)5個(gè)濃度 (0、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL)，共60個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以無菌水為對(duì)照。

1.4 樣品采集

蠶豆根瘤菌菌種活化過程：首先將蠶豆根瘤菌菌株在固體YMA培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行接種，然后在溫度條件為28 ℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)3 d至菌苔豐滿后，再在培養(yǎng)豐滿的菌苔里用接種環(huán)挑選菌落于YMA的液體培養(yǎng)基中，并用搖床 (轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為28 ℃)充分振蕩3 d，得到菌懸液[15]。

黃酮物質(zhì)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[16]：在50 mL的離心管中加入10 mL YMA培養(yǎng)基 (1 L配方為：酵母粉1.0 g，甘露醇10.0 g，氯化鈉0.1 g，七水硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀0.5 g，碳酸鈣1.0 g，瓊脂18～20 g，pH 6.6～7.0)；接著分別加入5 mL黃酮類物質(zhì) (柚皮素、橙皮素、槲皮素、染料木素)；然后再加入25 μL蠶豆根瘤菌菌株的懸濁液培養(yǎng)，而對(duì)照管中則分別加入5 mL無菌鹽水和25 μL根瘤菌菌株懸濁液，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)；最后將離心管在旋轉(zhuǎn)搖床 (轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度為28 ℃)振蕩48 h，得到待測(cè)菌懸液，用于根瘤菌數(shù)量、根瘤菌吸光度以及根瘤菌菌落直徑的測(cè)定。

1.5 測(cè)定方法

根瘤菌數(shù)量測(cè)定：采用菌落平板計(jì)數(shù)法；根瘤菌吸光度測(cè)定：采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 (MY13490022)；根瘤菌直徑測(cè)定：采用德國(guó)麥思德不銹鋼一體式游標(biāo)卡尺 (MASTERPROOF428) 測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)與分析

采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理與作圖，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析 (LSD法，P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃酮種類及濃度對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響

2.1.1柚皮素對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，柚皮素對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的具有顯著的促進(jìn)作用。與對(duì)照 (CK) 相比，在添加濃度為0.4，0.8，1.2，1.6 μg/mL時(shí)，蠶豆根瘤菌的數(shù)量分別顯著提高了52.38%、228.57%、300%和142.86%。此外，隨著柚皮素濃度的增加，蠶豆根瘤菌數(shù)量呈先增加后降低的生長(zhǎng)趨勢(shì)，且在1.2 μg/mL時(shí)數(shù)量達(dá)到最多。上述結(jié)果說明，柚皮素在一定的濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)，但過高濃度的柚皮素則對(duì)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。

不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著 (P< 0.05)。

圖1不同濃度的柚皮素對(duì)蠶豆根瘤菌數(shù)量的影響
Fig.1 Effects of different concentrations of naringenin on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.2橙皮素對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響

橙皮素對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響見圖2，隨著橙皮素濃度的增加，蠶豆根瘤菌數(shù)量表現(xiàn)出逐漸增加的生長(zhǎng)趨勢(shì)。與對(duì)照 (CK) 相比，橙皮素濃度在0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL時(shí)，蠶豆根瘤菌數(shù)量分別顯著增加了2.29、3.14、3.62、4.38倍，說明橙皮素對(duì)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。

不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著 (P< 0.05)。

圖2不同濃度的橙皮素對(duì)蠶豆根瘤菌數(shù)量的影響
Fig.2 Effects of different concentrations of hesperetin on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.3槲皮素對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，槲皮素對(duì)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)亦有明顯的促進(jìn)效應(yīng)。隨著槲皮素濃度的增加，蠶豆根瘤菌數(shù)量呈現(xiàn)先增后減的生長(zhǎng)趨勢(shì)，在濃度1.2 μg/mL時(shí)根瘤菌數(shù)量達(dá)到頂峰。與對(duì)照(CK)相比，在槲皮素濃度為0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL時(shí)，蠶豆根瘤菌數(shù)量分別增加了114.29%、147.62%、342.86%和266.67%，且達(dá)到顯著性差異水平。說明槲皮素在合理的濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)，但濃度過高則會(huì)抑制蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)。

不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著 (P< 0.05)。

圖3不同濃度的槲皮素對(duì)蠶豆根瘤菌數(shù)量的影響
Fig.3 Effects of different concentrations of quercetin on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.4染料木素對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響

染料木素對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)亦有顯著的促進(jìn)作用見圖4。

不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著 (P< 0.05)。

圖4不同濃度染料木素對(duì)蠶豆根瘤菌數(shù)量的影響
Fig.4 Effects of different concentrations of genistein on the quantity of faba bean rhizobia

與對(duì)照 (CK) 相比，隨著染料木素濃度的增加 (0.4～1.6 μg/mL)，根瘤菌數(shù)量分別顯著增加了2.38、3.38、4.62和6.48倍。此外，隨著染料木素濃度的增加，蠶豆根瘤菌數(shù)量呈現(xiàn)出遞增的生長(zhǎng)趨勢(shì)，且在1.6 μg/mL濃度時(shí)根瘤菌數(shù)量達(dá)到最大值 (136 × 106個(gè))。上述結(jié)果說明，染料木素可以明顯有效地促進(jìn)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)。

2.1.5不同黃酮類物質(zhì)對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的影響

黃酮類物質(zhì)對(duì)蠶豆根瘤菌數(shù)量的影響效應(yīng)見圖5。促進(jìn)效應(yīng)表現(xiàn)為：染料木素 > 橙皮素 > 槲皮素 > 柚皮素。在低濃度0.4 μg/mL時(shí)，橙皮素、槲皮素及染料木素的蠶豆根瘤菌數(shù)量較柚皮素分別顯著增加了50.00%、40.63%和56.25%，而在0.8 μg/mL時(shí)沒有顯著差異。在濃度1.2 μg/mL時(shí)，槲皮素、染料木素的蠶豆根瘤菌數(shù)量亦高于柚皮素與橙皮素；而在高濃度1.6 μg/mL時(shí)染料木素的蠶豆根瘤菌數(shù)量顯著高于其他3個(gè)黃酮類物質(zhì)。上述結(jié)果說明，黃酮類物質(zhì)可影響蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)。

不同小寫字母表示不同黃酮類物質(zhì)在同一濃度下差異顯著 (P< 0.05)。

圖5不同黃酮類物質(zhì)對(duì)蠶豆根瘤菌數(shù)量的影響
Fig.5 Effects of different flavonoids on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.6不同黃酮種類及濃度對(duì)蠶豆根瘤菌吸光度 (OD) 的影響

不同黃酮種類及濃度對(duì)蠶豆根瘤菌吸光度的作用效應(yīng)見表1。不同的黃酮類物質(zhì) (柚皮素、橙皮素、槲皮素和染料木素) 對(duì)蠶豆根瘤菌吸光度都有顯著的影響，而黃酮類物質(zhì)在不同濃度下對(duì)蠶豆根瘤菌吸光度亦有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。與對(duì)照 (CK) 相比，添加濃度在0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL時(shí)，柚皮素的蠶豆根瘤菌吸光度 (OD) 分別顯著提高了1.23、1.92、5.38和3.46倍，橙皮素的蠶豆根瘤菌吸光度 (OD) 分別顯著提高了2.85、8.54、12.92和13.69倍，槲皮素的蠶豆根瘤菌吸光度 (OD) 分別顯著提高了5.69、6.00、7.15和5.92倍，染料木素的蠶豆根瘤菌吸光度 (OD) 分別顯著提高了1.54、2.08、2.77和4.38倍，且柚皮素和槲皮素在濃度為1.2 μg/mL時(shí)吸光度最大，而橙皮素和染料木素在濃度為1.6 μg/mL時(shí)吸光度最大，以橙皮素的促進(jìn)作用最為顯著。上述說明，黃酮類物質(zhì)可以有效地促進(jìn)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)，但不同黃酮種類的有效濃度范圍是不同的。

表1 不同黃酮種類及濃度對(duì)蠶豆根瘤菌吸光度 (OD) 的影響Table 1 The effects of different flavonoids and their concentrations on the absorbance of rhizobia

注：不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著 (P< 0.05)。

2.2 不同黃酮種類及濃度對(duì)蠶豆菌落生長(zhǎng)的影響

由表2可知，黃酮類物質(zhì) (柚皮素、橙皮素、槲皮素、染料木素) 對(duì)蠶豆根瘤菌菌落大小均有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。與對(duì)照 (CK) 相比，添加濃度在0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL時(shí)，柚皮素的蠶豆根瘤菌菌落直徑分別顯著增加了1.56、2.34、4.05和1.21倍，橙皮素的蠶豆根瘤菌菌落直徑分別顯著增加了1.78、3.26、4.66和1.81倍，槲皮素的蠶豆根瘤菌菌落直徑分別顯著增加了1.44、3.44、5.59和2.68倍，染料木素的蠶豆根瘤菌菌落直徑分別顯著增加了1.63、2.10、3.01和5.33倍，并且皆在1.2 μg/mL時(shí)菌落直徑最大，分別為2.9、3.4 mm和4.0 mm (除染料木素在1.6 μg/mL時(shí)菌落直徑最大外)，以槲皮素的促進(jìn)效應(yīng)最明顯。上述結(jié)果說明，適宜濃度的黃酮類物質(zhì)可以有效地促進(jìn)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)，但不同的黃酮種類具有不同的有效濃度范圍。

表2 不同黃酮種類及濃度對(duì)蠶豆根瘤菌菌落直徑大小的影響Table 2 The effects of different flavonoids and their concentrations on the colony diameter of rhizobia mm

注：不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著 (P< 0.05)。

3 結(jié)論與討論

根瘤菌是一類生活在土壤中的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，在合適的條件下，根瘤菌能侵染豆科植物并與之進(jìn)行共生結(jié)瘤固氮。根瘤菌與豆科植物的共生是生物固氮體系中作用最強(qiáng)的體系，據(jù)估計(jì)所固定的氮約占生物固氮總量的65%，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著極其重要的作用；根系分泌物在根際相互作用中起著 “語(yǔ)言” 的作用，而根系分泌物中黃酮類物質(zhì)作為誘導(dǎo)特異根瘤菌對(duì)寄主植物根系進(jìn)行識(shí)別和定殖的重要信號(hào)分子，在結(jié)瘤過程中起關(guān)鍵作用[17]。Paul等[18]和Lian等[19]的研究表明，小麥根系分泌物可以誘導(dǎo)大豆結(jié)瘤因子的合成。李白[20]的研究亦發(fā)現(xiàn)，玉米//蠶豆系統(tǒng)中外源添加玉米根系分泌物顯著促進(jìn)了蠶豆的結(jié)瘤作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì) (柚皮素、橙皮素、槲皮素與染料木素) 均顯著影響蠶豆根瘤菌的數(shù)量、吸光度以及菌落直徑大小，其中染料木素對(duì)根瘤菌數(shù)量、橙皮素對(duì)根瘤菌吸光度以及槲皮素對(duì)根瘤菌菌落直徑的效應(yīng)最大。此外。黃酮類物質(zhì)的濃度也顯著影響蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)，隨著濃度的增加，添加柚皮素、槲皮素的蠶豆根瘤菌數(shù)量、吸光度及菌落直徑大小均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，并在濃度為1.2 μg/mL時(shí)根瘤菌生長(zhǎng)效應(yīng)最顯著；而橙皮素和染料木素的效應(yīng)則呈遞增趨勢(shì)，除蠶豆根瘤菌菌落直徑大小隨橙皮素濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)外。這些發(fā)現(xiàn)說明，不同的黃酮種類及其在不同濃度范圍對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)的效應(yīng)不同，并且在合理的濃度下可以有效促進(jìn)蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)。

豆科作物通過根瘤菌和豆科作物根際的信號(hào)識(shí)別啟動(dòng)固氮過程，而黃酮類物質(zhì)分泌作為結(jié)瘤作用的初始信號(hào)，通過作用于土壤中自由存在的根瘤菌而誘導(dǎo)根瘤菌結(jié)瘤基因的表達(dá)，激活根瘤菌蛋白Nod D，在Nod D的協(xié)同下，誘導(dǎo)根瘤菌結(jié)瘤基因的表達(dá)，合成專一性極高的脂-二殼糖寡糖 (LCOs)，即結(jié)瘤因子[20-27]。然而，這是一個(gè)非常復(fù)雜的根際過程，因此本實(shí)驗(yàn)中探討的幾個(gè)黃酮類物質(zhì)是否都作為信號(hào)物質(zhì)參與了蠶豆結(jié)瘤根際過程，哪種黃酮類物質(zhì)在結(jié)瘤過程發(fā)揮最關(guān)鍵的作用，還需要探索與證實(shí)。

本研究中，柚皮素、橙皮素、槲皮素與染料木素對(duì)蠶豆根瘤菌的數(shù)量、吸光度以及菌落直徑大小均有明顯的影響，且每種黃酮物質(zhì)的促進(jìn)效應(yīng)各不同。此外。黃酮類物質(zhì)的濃度也顯著影響蠶豆根瘤菌的生長(zhǎng)，蠶豆根瘤菌的數(shù)量、吸光度及菌落直徑大小均隨柚皮素、槲皮素濃度增加而呈先增加后降低，且均在濃度為1.2 μg/mL 時(shí)數(shù)值達(dá)到最大；根瘤菌的數(shù)量、吸光度及菌落直徑大小則隨著橙皮素和染料木素濃度增加而增加，其中染料木素在濃度為1.6 μg/mL時(shí)菌落直徑達(dá)到最大，最大值為值3.89 mm。