延黃牛ELOVL6基因cDNA序列克隆及其在各組織間的表達(dá)差異

胡忠昌，曹 陽，吳 健，秦立紅，金海國，趙玉民*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延邊 133002）

超長鏈脂肪酸延伸酶家族（Elongase of Very Long Chain Fatty Acids，ELOVLs）可以催化飽和與單不飽和脂肪酸的延伸，是哺乳動物體內(nèi)長鏈脂肪酸延伸和合成反應(yīng)過程中所必需的酶。其中，ELOVL6基因在脂質(zhì)含量較高的組織或者器官中（如肝臟、脂肪組織和腎上腺）表達(dá)較高。ELOVL6的主要功能是催化單不飽和脂肪酸的合成，也是治療代謝性疾病的靶基因[1]，并且ELOVL6基因加劇肝臟的炎癥反應(yīng)和肝臟損傷，是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝炎形成的重要因素[2]，是哺乳動物動脈硬化的主要參與基因[3]。ELOVL6基因是很重要的能量平衡因子，也是許多代謝性疾病的誘導(dǎo)因子[4]。Zhang等[5]在研究miRNA對ELOVL6基因表達(dá)的調(diào)控機制中發(fā)現(xiàn)，該基因在許多組織中廣泛表達(dá)，尤其是在腎臟和肝臟組織中高表達(dá)，并且還發(fā)現(xiàn)雞ELOVL6基因受miR-22-3P的影響來控制雞肝臟脂質(zhì)代謝。有學(xué)者對小鼠ELOVL6基因進行敲除后發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞中脂肪酸去飽和指數(shù)顯著下降，在小鼠的肝臟和肺臟中亞油酸的含量也顯著下降，這說明敲除小鼠ELOVL6基因能導(dǎo)致其對外源長鏈脂肪酸的攝取，以及引起脂肪細(xì)胞中亞油酸的明顯減少[6]。在研究肉牛脂肪酸代謝和脂肪沉積中發(fā)現(xiàn)ELOVL6基因在PPAR和脂肪酸代謝信號通路中發(fā)揮重要的作用[7]。

“延黃?！笔俏覈?jīng)過27年選育而成的優(yōu)秀肉牛品種，具有適應(yīng)性強、生長速度快、產(chǎn)肉率高等優(yōu)點，是延邊具有鮮明地域特點和朝鮮族特色的高檔肉牛品種[8]。本研究旨在分析延黃牛ELOVL6基因序列，明確其基因結(jié)構(gòu)和在各組織間的表達(dá)差異，為延黃牛ELOVL6基因功能研究、肉用性能和經(jīng)濟性狀的選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 延黃牛來源于吉林省琿春市吉興牧業(yè)有限公司，屠宰后快速取心、肝、肺、腎、十二指腸、胃、背最長肌和皮下脂肪組織，用滅菌剪刀剪成小塊，放入凍存管且做好標(biāo)記，液氮保存。

1.2 引物設(shè)計與合成 按照說明書，用Trizol法提取延黃牛肝臟組織總RNA。根據(jù) GenBank 中已發(fā)表的牛ELOVL6基因的序列信息（ NM_001102155.1），用Primer5軟件設(shè)計得到 F、R，擴增后獲得 ELOVL6基因 CDS 區(qū)。在核苷酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計具有特異性的定量引物ELOVL6-FQ的上下游引物，以β-actin基因（GenBank登錄號：NM_173979）作為內(nèi)參基因，引物信息見表1。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 ELOVL6基因RT-PCR擴增及克隆 RT-PCR反應(yīng)體 系（50 μL）：2×ES Taq MasterMix 反 應(yīng) 液 25 μL，cDNA 2.5 μL，上下游引物各取 1.25 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性2 min；95℃變性30 s；54℃退火45 s，72℃延伸30 s，共34個循環(huán)；72℃終延伸5 min，產(chǎn)物4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測正確后利用 DNA純化回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行切膠回收，利用pMD-18T Vector將PCR膠回收片段克隆到T載體16℃連接30 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，加入LB培養(yǎng)液搖菌復(fù)蘇1 h后，菌液涂布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）抗性的LB平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。隨機挑取8份陽性單菌落，過夜搖菌，提取相應(yīng)質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板（1:105），按照ELOVL6基因擴增的引物和反應(yīng)條件進行菌落PCR擴增鑒定。將鑒定結(jié)果正確的菌液送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4 實時定量PCR反應(yīng)體系及條件 QRT-PCR反應(yīng)體系 20 μL：2×ES Taq MasterMix 反應(yīng)液 10 μL，上、下游引物（10 μmmol/L）各 0.5 μL，模板 1 μL，滅菌蒸餾水8 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，從第2步開始45個循環(huán)；95℃ 5 s，65℃ 1 min，然后溫度以5℃/s的速率從65℃遞增到97℃最后降到40 ℃保存。

1.5 延黃牛ELOVL6基因生物信息學(xué)分析 將測序結(jié)果利用SeqMan軟件進行序列拼接，獲得延黃牛ELOVL6基因完整CDS序列，并通過EditSeq軟件獲得相應(yīng)的氨基酸序列。利用DNAstar.Megalign軟件對測序結(jié)果與原序列進行比對，再通過ExPASY.Protparam軟件對測序結(jié)果進行蛋白理化特性分析。將氨基酸序列導(dǎo)入SWISS-MODEL軟件中進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)以及蛋白信號肽分析心分析：利用NetPhos 2.0 Server軟件對其進行磷酸化分析。

1.6 延黃牛ELOVL6基因在各組織間的表達(dá)差異分析以提取延黃牛各組織的cDNA為模板，進行實時定量熒光PCR，用Roche Lightcycler 480的相關(guān)軟件對所得數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析，通過分析可以直接得出ELOVL6基因和內(nèi)參基因β-actin在各組織間的表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計分析 每組試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 延黃?？俁NA提取及其電泳檢測結(jié)果 經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀下觀察。如圖1所示，可以看到3條清晰的條帶，從上到下依次為28S、18S和5S，可用于后續(xù)實驗。

圖1 延黃牛各組織總RNA的提取

表1 ELOVL6基因熒光定量PCR引物設(shè)計

2.2 延黃牛ELOVL6基因cDNA序列克隆及其相關(guān)生物信息學(xué)分析

2.2.1 目的基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳后鑒定結(jié)果 如圖2所示，目的條帶明亮，可用于下一步實驗。

圖2 延黃牛ELOVL6基因RT-PCR產(chǎn)物擴增電泳圖

2.2.2 目的基因重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定結(jié)果 如圖3所示，所得條帶長度為載體中插入的目的片段長度。

圖3 延黃牛ELOVL6基因重組質(zhì)粒菌落PCR電泳圖

2.2.3 克隆延黃牛ELOVL6基因核苷酸序列測定結(jié)果延黃牛ELOVL6基因核苷酸序列：5'-GTAGCGACTCC GAAGATCAGCCCCAGTGAACATGTCAGTGTTGAC TTTACAAGAATATGAATTCGAAAAGCAGTTCAACG AGAATGAAGCCATCCAGTGGATGCAGGAAAACTG GAAGAAATCTTTCCTGTTTTCCGCCCTGTATGCTG CCTTTGTCTTTGGTGGTCGGCACCTAATGAACAAG CGGGCGAAGTTCGAGCTGAGGAGCCTTTAGTGCT CTGGTCTCTGACCCTTGCAGTCTTCAGTATATTCG GTGCTCTTCGAACTGGTGCTTATATGGTGTACACT GTGATGACCAAAGGCCTGAAGCATTCAGTTTGTG ACCAGGGTTTTTACAATGGACCTGTCAGCAAATTC TGGGCTTATGCATTTGTGCTAAGCAAAGCACCCGA ACTAGGAGATACAATATTCATTATTCTGAGGAAGC AGAAGCTGATCTTCCTGCACTGGTACCACCACATC ACTGTGCTTCTGTACTCCTGGTACTCCTACAAGGA CATGGTTGCTGGGGGTGGTTGGTTTATGACTATGA ACTATAGCGTGCACTCTGTGATGTACTCTTACTATG CCTTGCGAGCAGCAGGTTTCCGAGTCTCCCGGAA GTTCGCCATGTTCATCACGTTGTCCCAGATCATTC AGATGCTGATAGGCTGTGTCATTAATTACCTGGTCT TCCAGTGGATGCAGCATGACCAGTGTTACTCTCAC TTTCAGAACATCTTCTGGTCCTCACTCATGTACCTC AGCTACTTCGTGCTCTTCTGCCACTTCTTCTTTGA GGCCTACATCGGCAGCAAGATGAGGAAAGCAACG AAAGCTGACTAGTGTCGGAACTGAGGAGGAAGCC GTAGCTCAGGGTCATCAAGAAAAATAACAGACAA AAGAAAATGGCACAAGGGAATCACA-3'。

將克隆序列(YHCattle)與原序列(ELOVL6-CDS)進行比對，如圖4所示，在第281 bp處有1個堿基缺失，973 bp處有1個堿基增添。將測序結(jié)果翻譯為氨基酸序列與原氨基酸序列比對沒有發(fā)現(xiàn)有氨基酸的突變（圖5）。延黃牛ELOVL6基因核苷酸序列與在GenBank中人、豬、小鼠和羊核苷酸序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與山羊（NM_001314257.1）核苷酸序列的同源性為96%，而與小鼠（NM_130450.2）核苷酸序列的同源性僅僅只有15.3%（圖6）。

圖4 克隆序列與牛ELOVL6（NM_001102155.1）序列比對結(jié)果

圖5 克隆序列與牛ELOVL6(NM_001102155.1)氨基酸比對結(jié)果

圖6 延黃牛ELOVL6同源性分析和系統(tǒng)進化樹

對延黃牛ELOVL6基因測序結(jié)果進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖7所示，無α螺旋和β折疊。通過對延黃牛ELOVL6基因編碼的氨基酸親水性和疏水性進行分析，結(jié)果如圖8所示，大多數(shù)氨基酸集中在疏水區(qū)且最大值接近2.5；對其進行磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在18個氨基酸磷酸化位點（分值＞0.5），分別為絲氨酸（Serine）12處、酪氨酸（Tyrosine）2處和蘇氨酸（Threonine）4處（圖9）。

圖7 SWISS-MODEL預(yù)測延黃牛 ELOVL6蛋白三維結(jié)構(gòu)模型

圖8 延黃牛ELOVL6基因蛋白氨基酸親水性分析結(jié)果

圖9 延黃牛ELOVL6基因磷酸化位點分析

2.2.4 延黃牛ELOVL6基因在各組織間的表達(dá)差異分析

如圖10所示，ELOVL6基因在延黃牛不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平存在明顯差異，在皮下脂肪組織中的表達(dá)量極顯著高于其他組織(P＜0.001)，在其他組織的表達(dá)量從高到低依次是肝、胃、腎、心、肺、肌肉和十二指腸。

圖10 延黃牛 ELOVL6基因在各組織間的表達(dá)差異

3 討 論

ELOVL6基因是一種重要的長鏈脂肪酸延伸和合成反應(yīng)的限速酶，超長鏈脂肪酸在哺乳動物細(xì)胞膜形成、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，而棕櫚酸可以進一步延伸成硬脂酸合成為超長鏈脂肪酸，ELOVL6是將棕櫚酸轉(zhuǎn)化成硬脂酸的限速酶，對ELOVL6基因的深入研究可以改善牛肉類中有益脂肪的組成[9]。在研究奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，ELOVL6基因影響細(xì)胞中單不飽和脂肪酸的生成，還發(fā)現(xiàn)該基因?qū)χ畏e累沒有影響，主要功能是催化C16脂肪酸延伸為C18脂肪酸[10]。肝臟和肌肉是脂肪酸代謝的重要合成部位， Zhang等[11]在研究豬肉質(zhì)基因時發(fā)現(xiàn)，ELOVL6基因可能是豬第8號染色體肌肉C18:1n-9/C16:1n-7基因座位的候選基因。Takamura等[12]在小鼠體內(nèi)敲除ELOVL6基因后發(fā)現(xiàn)膽固醇含量明顯降低，這說明該基因的敲除能夠抑制胞內(nèi)脂質(zhì)積累，增加膽固醇的排放，進而減少粥樣斑塊的形成，降低動脈硬化的發(fā)生幾率。功能失調(diào)性脂肪酸在乙型糖尿病中β細(xì)胞功能性障礙和減少的發(fā)病機制中起重要作用[13]。ELOVL6基因可以通過修飾單不飽和脂肪酸來發(fā)揮在肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗中的作用。Zhao等[14]通過對瘦素受體缺陷型小鼠ELOVL6基因的敲除發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)β細(xì)胞顯著增加，細(xì)胞凋亡減少，胰島素的適應(yīng)性增加和血糖控制得到改善，這就說明ELOVL6基因是脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)異常與β細(xì)胞功能障礙，胰島素炎癥和β細(xì)胞凋亡聯(lián)系起來的一個關(guān)鍵因素。

本研究首次克隆得到延黃牛 ELOVL6基因核苷酸序列，含有906 bp的開放閱讀框，預(yù)測其編碼264個氨基酸的多肽，預(yù)測分子量為31.282 ku，理論等電點為9.46，分子式為C1478H2171N355O362S18。其中酸性氨基酸：天冬氨酸（D）5個占1.9%，谷氨酸（E）9個占3.4%。堿性氨基酸：賴氨酸（K）17個占6.4%，精氨酸（R）9個占3.4%，組氨酸（H）9個占3.4%。疏水性氨基酸一共133個占50.37 %，這一結(jié)果與吳敏等[15]報道結(jié)果相近，說明延黃牛與奶山羊同源性相近，為了證實此結(jié)果，本實驗對延黃牛 ELOVL6核苷酸序列與在GenBank中已公布的人、豬、小鼠和羊核苷酸序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)與山羊（NM_001314257.1）核苷酸序列的同源性為96 %，而與小鼠（NM_130450.2）核苷酸序列的同源性僅僅只有15.3%，說明ELOVL6基因在不同品種間具有較強的保守性，與哺乳動物的進化水平接近，符合物種的進化規(guī)律。通過對克隆序列與原序列比對，發(fā)現(xiàn)在281 bp處有1個堿基缺失，973 bp處有1個堿基增添，為了證實該堿基缺失是否影響蛋白結(jié)構(gòu)，將其核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，與原氨基酸序列比對未發(fā)生氨基酸的改變，說明該突變是同義突變，這一結(jié)果與陳煜[16]在研究秦川牛多態(tài)性所報道的結(jié)果一致。

本實驗還檢測了ELOVL6基因在延黃牛各組織間的差異表達(dá)，結(jié)果表明該基因在延黃牛皮下脂肪組織中的表達(dá)量極顯著高于其他組織，說明該基因可能是調(diào)控脂肪酸代謝的關(guān)鍵基因，在肝臟和胃組織中也顯著表達(dá)。肝臟是機體主要的代謝器官，發(fā)揮著去氧化、蛋白質(zhì)的合成和儲存肝糖等作用，胃是主要的消化器官，ELOVL6基因參與許多代謝反應(yīng)所以在肝臟和胃中高度表達(dá)。本試驗中，ELOVL6基因在其他組織的表達(dá)量從高到低依次是腎、心、肺、肌肉和十二指腸，這一結(jié)果與楊志剛等[17]報道結(jié)果一致。

目前對ELOVL6基因的研究主要集中在人類代謝疾病和人類癌癥等方面，少數(shù)人在奶牛乳腺炎癥、牛早期胚胎發(fā)育和脂肪酸代謝做過研究，而在牛肉質(zhì)選育和肉牛遺傳多態(tài)性分析方面研究甚少，加快對牛肉質(zhì)基因的研究可能會為肉牛的遺傳改良開辟新的方向，本實驗對延黃牛ELOVL6基因CDS區(qū)克隆發(fā)現(xiàn)存在2個突變位點，且該基因在延黃牛皮下脂肪中顯著表達(dá)，本課題下一步將對該基因SNP位點與延黃牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性進行研究，進一步探索該基因功能。

4 結(jié) 論

本實驗成功獲得延黃牛ELOVL6基因，共編碼264個氨基酸的多肽，預(yù)測其分子量為31.282 ku，理論等電點為9.46，為疏水性蛋白，無典型的信息肽切割位點，含有18個氨基酸磷酸化位點（分值＞0.5），存在2個突變位點，沒有引起氨基酸發(fā)生改變。延黃牛ELOVL6基因在各組織間存在差異表達(dá)，在皮下脂肪組織中表達(dá)量顯著高于其他組織。綜上所述，ELOVL6基因可能是影響牛脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)控基因，更深入地研究該基因?qū)姆肿舆z傳學(xué)角度為牛肉用性能和經(jīng)濟性狀的選育提供參考依據(jù)。