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    ESR1與PGR基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘腦-垂體-卵巢軸的表達研究

    2018-10-23 01:53:06田志龍劉秋月王翔宇胡文萍王玉琴張效生張金龍儲明星
    中國畜牧雜志 2018年10期
    關鍵詞:小尾寒羊下丘腦垂體

    田志龍,劉秋月,王翔宇,狄 冉,胡文萍,王玉琴,張效生,張金龍,儲明星*

    (1. 中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,北京 100193;2. 河南科技大學動物科技學院,河南洛陽 471003;3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300381)

    綿羊產羔數是一個極其復雜的性狀,受諸多因素影響。大多數綿羊屬于季節(jié)性發(fā)情、單羔品種,且綿羊產羔性狀的遺傳力較低,僅為0.1左右,常規(guī)育種技術在短期內很難改良產羔性狀。因此,如何較快提高綿羊產羔數是養(yǎng)羊業(yè)亟待解決的難題。雌激素受體和孕激素受體都屬于類固醇核受體超家族[1]。綿羊雌激素受體α由 ESR1基因(Estrogen Receptor 1)編碼,具有調控轉錄蛋白質的功能,通過與靶基因上的特異性效應元件相結合,從而調節(jié)靶基因的表達[2]。雌激素受體α與雌激素結合后,對胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育都發(fā)揮著重要作用[3]。國內外許多研究證實ESR基因是調控豬高產仔數的主效基因之一[4]。Hewitt 等[5]研究表明,敲除ESR基因后將導致小鼠出現促黃體生成素(LH)調節(jié)紊亂、卵巢不排卵等現象。研究表明,ESR基因與小尾寒羊[6]和湖羊[7]多羔繁殖緊密相關。孕激素受體(Progesterone Receptor,PGR)屬于甾體激素核受體家族的成員,是配體活化的轉錄因子,可與孕激素結合后發(fā)揮生理功能,在動物的發(fā)育、生殖、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著十分重要的作用[8-9]。許多研究表明PGR信號傳導是卵母細胞排卵所必須的[10]。Rowan等[11]發(fā)現,PGR缺失小鼠成年后大腦、子宮、卵巢均發(fā)生表型變化,并且無法排卵。綜上可知,ESR和PGR基因在動物繁殖中存在重要的作用,但其在不同繁殖力小尾寒羊群體的表達研究并不多見。

    綿羊FecB基因是學術界公認影響綿羊產羔數的主效基因[12]。在實際生產中發(fā)現在小尾寒羊群體中FecB基因野生型個體中存在產多羔的現象。使用Taqman探針法對小尾寒羊進行分型,選擇FecB基因突變野生型小尾寒羊,連續(xù)觀察黃體數并記錄產羔數(產羔數和黃體數均大于或等于2,則定義為多羔)。本研究獲得小尾寒羊FecB基因突變野生型單羔群體和多羔群體(下文簡稱單羔、多羔),采用反轉錄PCR結合實時熒光定量PCR技術檢測ESR1和PGR基因在不同繁殖力小尾寒羊群體中的表達差異,期望從轉錄水平初步揭示ESR1和PGR基因在綿羊多羔繁殖中的作用,為深入研究綿羊多羔性狀機理提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集和主要試劑 小尾寒羊(FecB野生型單羔和多羔)來自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場。挑選健康狀況良好的成年母羊各3只,使用陰道孕酮栓(Controlled Internal Drug Release,CIDR)進行同期發(fā)情處理,12 d后撤栓。在撤栓后45 h屠宰并立即采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟12種組織,液氮中保存,轉移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩NA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司(北京),2×Taq PCR Master Mix購于北京拓英坊生物技術有限公司(北京),反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)和熒光定量染料(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)均購于TaKaRa公司(大連)。

    1.2 組織總RNA的提取和檢測 采用動物組織總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA,并用NanoDrop 2000檢測提取RNA的純度和濃度,1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

    1.3 引物設計 根據GenBank提供的綿羊ESR1和PGR基因mRNA序列(登錄號分別為XM_012137956.2、XM_012169084.2),利用Primer Premier 6.0軟件進行跨外顯子引物設計,以GAPDH(NM_001190390.1)作為內參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物名稱和序列、退火溫度以及擴增片段大小見表1。

    1.4 cDNA合成 利用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA:PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL,Oligo dT Primer 1.0 μL,Random 6 mers 1.0 μL,5×PrimeScript Buffer(for Real Time)4.0 μL, 總 RNA 1.0 μg,RNase-Free ddH2O補足至總體積為20 μL。反轉錄反應條件:37℃15 min,85℃ 5 s,獲得cDNA第1鏈。全程在冰上操作。反轉錄產物進行5倍稀釋,用持家基因GAPDH進行PCR檢測,將符合標準的cDNA置于-20℃保存,以用于檢測目的基因的表達。

    1.5 RT-PCR反應 PCR體系總體積為20 μL:2×Taq PCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L 的上、下游引物各 0.5 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 8 μL。反應程序:95℃ 預變性 5 min;95℃ 變 性 30 s,60℃ 退 火 30 s,72℃ 延 伸30 s,30個循環(huán);72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小。

    1.6 實時熒光定量 PCR 利用 Roche Light Cycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR儀進行熒光定量檢測,反應體系總體積為 20 μL:2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,10 μmol/L的上、下游引物各 0.8 μL,RNase-Free ddH2O 6.4 μL,cDNA 模 板 2 μL。PCR程 序:95℃ 預 變 性 5 s,95℃變性10 s,60℃ 30 s,40個循環(huán);反應結束后對熔解曲線進行分析。以GAPDH基因為內參基因,每個樣品重復檢測3次。

    1.7 統計分析 采用 2-△△Ct法[13]計算目的基因相對表達量,用SPSS 19.0統計軟件對數據進行單因素ANOVA分析,使用LSD法進行多重比較,所有數據以平均值±標準誤表示。

    2 結果與分析

    2.1 總RNA提取與cDNA合成 提取不同繁殖力小尾寒羊各組織的總RNA,經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。28 S和18 S條帶清晰可見,且灰度值約為2:1,而5 S帶幾乎沒有,說明提取的總RNA無明顯降解。Nanodrop 2000檢測各組織RNA,A260/A280均在1.8~2.1,表明提取的RNA純度較高,可用于后續(xù)的熒光定量PCR反應。

    表 1 綿羊ESR1和PGR基因的引物信息

    2.2 綿羊ESR1、PGR基因組織表達譜 如圖1所示,GAPDH基因在小尾寒羊不同組織表達擴增效果良好,具有明顯內參基因特征。小尾寒羊多羔群體中ESR1基因在子宮、輸卵管、卵巢、垂體中高度表達;在大腦、小腦、下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織微弱表達。PGR基因在小尾寒羊多羔群體的輸卵管、子宮、卵巢高表達,在其他組織微弱表達。小尾寒羊單羔群體中ESR1、PGR基因的表達模式與多羔群體類似。

    圖1 多羔小尾寒羊(A)和單羔小尾寒羊(B)各組織中ESR1和PGR基因的PCR產物凝膠電泳圖

    2.3 綿羊下丘腦-垂體-卵巢軸相關組織中ESR1和PGR基因的表達 如圖2所示,ESR1基因在小尾寒羊子宮、輸卵管的表達量最高,其次是在卵巢,在下丘腦、垂體的表達量最低。ESR1基因在多羔小尾寒羊子宮、卵巢、輸卵管、垂體和下丘腦組織中的表達量與單羔小尾寒羊無顯著差異(P>0.05)。PGR基因在小尾寒羊輸卵管、子宮的表達量最高,其次是卵巢,在下丘腦、垂體組織的表達量最低。PGR基因在多羔小尾寒羊輸卵管、子宮、卵巢和下丘腦中的表達量均極顯著高于單羔小尾寒羊(P<0.01);在垂體組織的表達量顯著高于單羔小尾寒羊(P<0.05)。

    圖 2 ESR1、PGR基因在不同群體小尾寒羊的組織表達

    3 討 論

    3.1 ESR1基因表達對動物繁殖的影響 研究發(fā)現,雌激素受體與雌激素結合后,對胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用[14]。本研究發(fā)現,ESR1基因在卵泡期不同繁殖力小尾寒羊群體的子宮、輸卵管的表達量最高,其次是在卵巢,在下丘腦、垂體組織的表達量最低。丁威[15]發(fā)現,在豬早期階段卵巢中雌激素受體主要在卵巢表皮細胞、卵母細胞巢中的卵原細胞和卵母細胞以及原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞的核中表達。白淑等[16]使用免疫組織和熒光定量技術檢測濟寧青山羊出生后發(fā)育過程中雌激素受體在子宮的定位及表達,結果發(fā)現雌激素受體1在子宮腔上皮、腺上皮、基質、血管內皮和平滑肌細胞的胞核中均有表達,證明了雌激素受體1參與調節(jié)子宮內膜與肌層的增殖和分化。劉欣[17]以成年母牛為研究對象,發(fā)現卵泡期ESR1和PGR在卵巢中表達量最高,其次是輸卵管,子宮最低。Laws等[18]在小鼠中發(fā)現下丘腦-垂體-卵巢軸ESR1信號異常會導致卵巢上皮腫瘤的發(fā)生。ESR1過表達后,會對甲氧氯的敏感性增強,可能導致卵泡閉鎖[19]。Winuthayanon等[20]研究證明,雌激素通過ESR1作用于子宮基質發(fā)揮其生理功能,之后通過ESR1作用于子宮上皮繼續(xù)發(fā)揮功能,推測可能是其與雌激素作用誘導子宮細胞增殖分化[21]。Pawar等[22]研究證明,ESR1在雌性動物子宮基質細胞分化及子宮蛻膜化的過程中發(fā)揮著關鍵作用。Cerny等[23]通過轉錄組數據分析,認為雌激素和ESR1結合后調節(jié)輸卵管相關基因的表達和生理作用。本研究中ESR1在子宮中的高表達量可能是由于埋植陰道栓刺激所致;ESR1基因在小尾寒羊單、多羔群體子宮、輸卵管、卵巢的組織均有表達,暗示ESR1可能在小尾寒羊發(fā)情或者排卵的過程中起著重要作用,但具體機制有待繼續(xù)研究。

    3.2 PGR基因表達對動物繁殖的影響 研究發(fā)現,孕激素受體在動物機體的所有主要生理系統中低表達,但在中樞神經系統和雌性動物生殖道中高表達[24]。本研究通過熒光定量PCR檢測了卵泡期小尾寒羊單羔和多羔群體下丘腦-垂體-性腺軸繁殖調控組織PGR基因的表達差異,結果發(fā)現PGR主要在輸卵管、子宮、卵巢、垂體、下丘腦表達,這和嚙齒動物、哺乳動物表達模式相似。如在豬的發(fā)情期和妊娠早期的子宮組織[25]以及在嚙齒動物卵巢[10]、輸卵管[26]組織均能檢測到PGR基因的表達。PGR缺失小鼠成年后大腦、子宮、卵巢均發(fā)生表型變化,并且無法排卵[11]。本研究還發(fā)現,PGR在小尾寒羊多羔群體輸卵管、子宮、卵巢、下丘腦的表達量極顯著高于單羔群體;在多羔群體垂體中的表達量顯著高于單羔群體。Chen等[27]的研究發(fā)現,PGR基因在高繁殖力的策勒黑羊群體的表達量高于低繁殖力的和田羊,這和本研究的結果一致,PGR基因存在多態(tài)位點可以影響小尾寒羊產羔數[28]。這些結果暗示PGR基因參與小尾寒羊多羔性狀的調控。

    4 結 論

    本研究通過RT-PCR技術發(fā)現,ESR1和PGR基因在小尾寒羊單、多羔群體大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織均有表達;熒光定量PCR分析發(fā)現ESR1、PGR基因分別在小尾寒羊子宮和輸卵管組織中高表達;PGR基因在多羔群體下丘腦-垂體-卵巢軸組織中的表達量顯著高于單羔群體,暗示PGR在小尾寒羊多羔性狀的調節(jié)過程中起到一定作用。

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