風(fēng)濕寧膠囊對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療效果的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究?

王一婕，王永輝，劉佳維，周 然

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030006)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)作為自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)炎癥過(guò)度活躍的免疫應(yīng)答為特征，其免疫系統(tǒng)將正常細(xì)胞作為病原體錯(cuò)誤識(shí)別并進(jìn)行攻擊[1]，因此減輕炎癥反應(yīng)介導(dǎo)下的免疫應(yīng)答是RA治療的重點(diǎn)。本研究FSN膠囊主治風(fēng)寒濕兼瘀血阻絡(luò)型痹癥，經(jīng)過(guò)多年臨床應(yīng)用證明可明顯改善患者癥狀、體征、延緩病情進(jìn)展，且抗炎作用良好[2]。

轉(zhuǎn)錄組是從轉(zhuǎn)錄水平研究細(xì)胞或器官在特定時(shí)間段所有基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的整體表達(dá)，其作為當(dāng)前最有效的高通量技術(shù)，可快速發(fā)現(xiàn)和鑒定標(biāo)志物和功能基因[3-5]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)識(shí)別與RA相關(guān)的差異表達(dá)基因[6-7]，為探索FSN膠囊治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可能的靶點(diǎn)提供初步的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

風(fēng)濕寧膠囊(FSN)由獨(dú)活、川牛膝、羌活、片姜黃、青風(fēng)藤、延胡索、川芎、砂仁、肉桂、三棱、麻黃、血竭、威靈仙、熟地黃、防風(fēng)、甘草和生姜17味藥組成，山西仁源堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(20160220); 完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma);免疫牛II型膠原(美國(guó)Chondrex100028); Tofacitinib(美國(guó)Selleck公司中國(guó)分公司S5001); 大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司); RNAlater? Solution (美國(guó)Thermofisher); TRIzol Plus RNA Purification Kit (美國(guó)ThermoFisher); TURBO DNA-freeTMKits (美國(guó)Sigma)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

StepOnePlus Real-Time PCR System (美國(guó)AB);Aligent生物分析儀(美國(guó)Aligent);Illumina HiSeq 4000 (美國(guó)Illumina)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

156只雄性SD大鼠, 2月齡, 體質(zhì)量(180±20) g, 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK京20120001)。

2 方法

2.1 模型構(gòu)建及分組給藥

參考《中醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8]制備CIA模型、CIA+寒濕復(fù)合模型大鼠，復(fù)合模型組大鼠置于人工氣候箱中模擬誘導(dǎo)RA的寒濕環(huán)境[Rh=(90±4)%, T=(6±2)℃]連續(xù)刺激8 h，每日1次，連續(xù)14 d；于實(shí)驗(yàn)第7天，在大鼠右后肢足爪、尾根、背部各注射Ⅱ型膠原乳液(1 mg·mL-1)0.1 mL，實(shí)驗(yàn)14 d同法加強(qiáng)免疫1次，制備復(fù)合模型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠動(dòng)物模型；CIA模型組除不進(jìn)行寒濕刺激外，余同復(fù)合模型組；正常組除7 d、14 d于相同部位皮下注射等量生理鹽水外，不施加任何刺激。

大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、CIA、復(fù)合模型組、FSN-CIA低劑量組(0.33 g/kg)、FSN-CIA中劑量組(0.66 g/kg)、FSN-CIA高劑量組(1.32 g/kg)、FSN-復(fù)合低劑量組(0.33 g/kg)、FSN-復(fù)合中劑量組(0.66 g/kg)、FSN-復(fù)合高劑量組(1.32 g/kg)、Tofacitinib組(15 mg/kg)、塞隆風(fēng)濕組(0.186 g/mL)各12只。正常組和模型組等量生理鹽水灌胃，各劑量FSN每日1次，Tofacitinib、塞隆風(fēng)濕每日1次，連續(xù)28 d。造模28 d后觀察各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)病理改變以及相關(guān)炎性因子水平變化，觀察FSN膠囊對(duì)不同模型大鼠的治療效果。

2.2 觀察評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.2.1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度 水容積法于造模完成后1 d對(duì)各組大鼠的后肢容積進(jìn)行測(cè)量，隔7 d 記錄1次容積。將d1測(cè)得的值作為基值，下一次測(cè)得的值與前一次比較計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度。腫脹度=(造模后容積-造模前容積)/造模容積×100%。

2.2.2 大鼠關(guān)節(jié)病理學(xué)觀察(HE染色) 28 d處死大鼠后剔除表面肌肉組織，將其后肢剪下用PBS (PH7.3)溶液沖洗3次，將各組踝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h。按以下步驟處理：脫鈣→脫水與透明→石蠟包埋→踝關(guān)節(jié)矢狀面切片→HE染色。

2.2.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中炎性細(xì)胞因子水平 28 d灌胃結(jié)束后取各組大鼠外周血離心分離血清，用ELISA檢測(cè)其中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究

2.4.1 大鼠關(guān)節(jié)滑膜提取 28 d灌胃結(jié)束，取正常、CIA模型、FSN-CIA高劑量組(FSNH)、復(fù)合模型組(HSCIA)、FSN-復(fù)合高劑量組(FSN-HSCIA)5組大鼠，每組12只，乙醚麻醉頸椎脫臼處死，置于75%酒精里浸泡15 min，沿膝關(guān)節(jié)中將皮膚剪開(kāi)，分離滑膜滑游離端切下置于液氮罐中，移至-80 ℃冰箱備用。

2.4.2 總RNA提取檢測(cè)及測(cè)序 提取5組大鼠滑膜組織總RNA，樣本檢測(cè)合格后，經(jīng)過(guò)mRNA的富集、片段化、反轉(zhuǎn)錄、末端加接頭構(gòu)建cDNA文庫(kù)。質(zhì)檢合格后使用Illumina HiSeq 4000測(cè)序，獲得原始測(cè)序短序列，經(jīng)過(guò)濾得到短序列Clean Reads為有效數(shù)據(jù)。

2.4.3 基因表達(dá)量和差異表達(dá)基因分析 使用Bowtie2軟件將clean reads比對(duì)到大鼠參考基因組序列上，RSEM軟件計(jì)算大鼠滑膜組織樣本中基因和轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量。采用基于泊松分布原理的PossionDis法篩選差異表達(dá)基因[9]。

2.4.4 生物信息學(xué)分析 選擇大鼠滑膜組織不同樣本間差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因本體論GO注釋功能分類和KEGG注釋分類，并進(jìn)行功能富集分析。

3 結(jié)果

3.1 FSN對(duì)模型組大鼠的治療效果

表1圖1、2顯示，從大鼠的整體狀況上看，模型組大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，與正常組比較滑膜增生、關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，炎性細(xì)胞因子水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CIA比較，復(fù)合模型組滑膜增生、關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，炎性細(xì)胞因子水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；FSN給藥組28 d后，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大鼠外周血中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平也有不同程度的顯著降低(P<0.0)；在關(guān)節(jié)病理方面，F(xiàn)SN治療組可以減輕滑膜細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也見(jiàn)不同程度減少，關(guān)節(jié)病理特征得到改善。

3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

3.2.1 測(cè)序及數(shù)據(jù)過(guò)濾結(jié)果 本研究利用Illumina Hiseq 4000測(cè)序平臺(tái)，每個(gè)樣品均產(chǎn)出53.27Mb的Raw Reads，經(jīng)過(guò)濾處理符合后續(xù)分析要求。

表1 FSN對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

注：與正常組比較：*P<0.05;與CIA模型組比較：△P<0.05;與模型組比較：▲P<0.05

圖1 FSN對(duì)模型大鼠外周血中細(xì)胞因子含量的影響注：A. FSN對(duì)模型大鼠血清IL-1β含量的影響；B.FSN對(duì)模型大鼠血清IL-6含量的影響；C.FSN對(duì)模型大鼠血清TNF-a含量的影響與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3.2.2 大鼠新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)結(jié)果 表2顯示，通過(guò)對(duì)5個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)分析，共獲得9070個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中蛋白編碼的新轉(zhuǎn)錄本為6684個(gè)，非編碼新轉(zhuǎn)錄本為2386個(gè)，獲得的新變異體4084個(gè)和2600個(gè)新基因。

表2 FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織5個(gè)樣本的新轉(zhuǎn)錄本類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.2.3 基因表達(dá)量分析和差異表達(dá)基因檢測(cè) 表3圖3顯示，通過(guò)對(duì)大鼠滑膜組織5個(gè)樣品的基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平計(jì)算分析。根據(jù)5個(gè)樣品的基因表達(dá)水平結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)分析了各個(gè)樣品間的差異表達(dá)基因。

3.2.4 差異表達(dá)基因GO功能和Pathway分析結(jié)果 圖4顯示，GO富集分析，大鼠滑膜組織CIA組與HSCIA組差異表達(dá)基因主要注釋到生物學(xué)進(jìn)程類別，包括生物學(xué)調(diào)節(jié)、免疫進(jìn)程等，細(xì)胞組分類別主要包括細(xì)胞、大分子復(fù)合物等；HSCIA組與FSN-HSCIA組差異表達(dá)基因注釋到生物學(xué)進(jìn)程類別主要富集在細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程等，細(xì)胞組分類別主要富集在核糖體亞基、細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物等。

表3 FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織5個(gè)樣品基因表達(dá)量統(tǒng)計(jì)比較

圖2 FSN對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)病理的影響(HE×200)注：A.正常組：大鼠未見(jiàn)明顯異常及增生，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、骨及軟骨破壞；B.CIA模型組：炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，骨及軟骨組織破壞;C.復(fù)合模型組：滑膜結(jié)締組織大量增生，關(guān)節(jié)軟骨表層纖毛狀撕裂，深入軟骨層、滲出明顯;D.風(fēng)濕寧CIA高劑量組：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，骨及軟骨破壞減少，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞增生;E.風(fēng)濕寧復(fù)合高劑量組：可見(jiàn)再生軟骨基質(zhì)，淺染的即為再生的軟骨母細(xì)胞

圖3 FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織5個(gè)樣品差異表達(dá)基因數(shù)注： X軸代表每組差異比對(duì)方案，Y軸代表相應(yīng)的差異表達(dá)基因數(shù)目。淺色代表上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目，深色代表下調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目

圖4 A.FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織CIA組與FSNH組差異基因GO功能分類；B.FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織CIA組與HSCIA組差異基因GO功能分類；C.FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織HSCIA組與FSN-HSCIA組差異基因GO功能分類

圖5顯示，KEGG通路富集分析，大鼠滑膜組織CIA組與HSCIA組差異表達(dá)基因富集于細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息進(jìn)程等總計(jì)31個(gè)通路，顯著富集在泛素介導(dǎo)的蛋白水解、苯丙氨酸等通路中。HSCIA組與FSN-HSCIA組差異表達(dá)基因注釋到細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息進(jìn)程等30個(gè)通路中，顯著富集在甲狀腺激素信號(hào)通路、吞噬體等信號(hào)通路中。CIA組與FSNH組差異表達(dá)基因富集于遺傳信息進(jìn)程、人類疾病總計(jì)3個(gè)通路，顯著富集在類固醇生物合成、核糖體2個(gè)通路中。

圖5 A.FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織CIA組與HSCIA組差異基因Pathway分類圖；B.FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織HSCIA與FSN-HSCIA組差異基因Pathway分類；C.FSN對(duì)模型大鼠滑膜組織CIA與FSNH組差異基因Pathway分類注：X軸代表DEG數(shù)目，Y軸代表KEGG功能分類

4 討論

RA以關(guān)節(jié)滑膜炎為基本特征，具體表現(xiàn)為無(wú)力、晨僵和關(guān)節(jié)酸痛、麻木等，屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，臨床常祛風(fēng)、除濕、散寒之品相須為用。白清佐提出的治痹驗(yàn)方風(fēng)濕寧膠囊以祛風(fēng)散寒除濕、活血通絡(luò)為主，以祛除疾病初期之邪實(shí)，并配伍補(bǔ)腎溫陽(yáng)、護(hù)衛(wèi)調(diào)營(yíng)之品以護(hù)其本，可謂標(biāo)本兼顧，在RA治療中取得很好的效果。風(fēng)邪善行數(shù)變，易挾寒濕之邪，故方中用大量獨(dú)活、羌活以祛全身上下之風(fēng)寒濕，防病邪深入；同時(shí)伍以麻黃、防風(fēng)益衛(wèi)解表，給寒濕之邪以出路；熟地養(yǎng)血和營(yíng)，青風(fēng)藤、威靈仙祛風(fēng)，兼引濕邪于外；配伍血竭、三棱功?；钛铕?，促進(jìn)關(guān)節(jié)局部血脈運(yùn)行，止痛消腫；伍以少量延胡索、川芎活血行氣通滯；少量辛溫之片姜黃內(nèi)行氣血，外散風(fēng)寒濕邪；砂仁、生姜理氣醒脾溫陽(yáng)，川牛膝、肉桂補(bǔ)腎溫陽(yáng)?？v觀全方，各藥配伍得當(dāng)，風(fēng)寒濕瘀兼顧，因此自20世紀(jì)80年代起以在醫(yī)院以制劑形式進(jìn)行處方用藥，在晉造福廣大RA患者。

FSN膠囊雖臨床療效頗顯，但具體作用機(jī)制并不明確，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行藥物干預(yù)，以獲得相關(guān)基因及通路信息，將為FSN膠囊的作用機(jī)制與藥物關(guān)系的研究提供相關(guān)前期判斷和方向。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，寒濕環(huán)境可明顯加重關(guān)節(jié)炎程度，復(fù)合模型較CIA受寒濕因素影響嚴(yán)重，寒濕刺激加重動(dòng)物模型自身免疫反應(yīng)，滑膜增生、腫脹度顯著升高，提示大鼠體內(nèi)寒濕內(nèi)阻、瘀血瘀滯之證的表現(xiàn)。前期FSN膠囊對(duì)模型組大鼠治療效果研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6和TNF-α的水平下降，炎癥相關(guān)因子的表達(dá)得到控制，推測(cè)RA的發(fā)病機(jī)制可能與多個(gè)蛋白異常表達(dá)及參與多條信號(hào)通路相關(guān)，其中一部分機(jī)制可能通過(guò)下調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)起到免疫抑制作用，而緩解炎癥癥狀。此基礎(chǔ)上選取治療效果較好的FSN高劑量組，對(duì)其干預(yù)前后的大鼠滑膜組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，進(jìn)一步探尋FSN膠囊治療RA的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，F(xiàn)SN膠囊在各個(gè)模型組和給藥組中，上調(diào)基因明顯要多于下調(diào)基因，表明FSN膠囊治療RA的作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)炎性因子分泌、調(diào)節(jié)異常表達(dá)蛋白，促進(jìn)抑炎因子或某些炎癥負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子表達(dá)，從而抑制炎癥信號(hào)通路的激活，改善關(guān)節(jié)滑膜組織的增生及炎癥，進(jìn)而起到治療RA的作用。

本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，YB-1在CIA vs HSCIA中顯著上調(diào)，在CIA vs FSNH中顯著表達(dá)下調(diào)，在HSCIA vs FSN-HSCIA中顯著下調(diào)，推測(cè)YB-1可能為FSN膠囊治療RA的關(guān)鍵蛋白之一。Y結(jié)合蛋白1是人類細(xì)胞中廣泛表達(dá)的Y-box結(jié)合蛋白家族之一，Y-box結(jié)合蛋白可能是促進(jìn)某些基因的表達(dá), 進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]。迄今為止，還未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱YB-1基因與治療RA相關(guān)，之后的工作將進(jìn)一步深入研究YB-1在FSN治療RA的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。本研究獲得的差異表達(dá)基因可作為RA的候選致病基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究，探究其在RA中的致病機(jī)制，這將有助于理解RA的發(fā)病機(jī)理，篩選RA的藥物靶點(diǎn)。

長(zhǎng)期以來(lái)，中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性為其機(jī)制研究帶來(lái)很大難度。中醫(yī)藥研究借助現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的研究方法，從分子水平多方位、多角度對(duì)中醫(yī)辨治理論及方藥作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究，建立不同方劑處理前后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)比對(duì)現(xiàn)有研究成果，構(gòu)建藥物影響的網(wǎng)絡(luò)通路，有利于從基因水平解釋中醫(yī)辨證論治理論和作用機(jī)制等問(wèn)題，為中醫(yī)藥復(fù)雜體系的研究和發(fā)展開(kāi)辟新的道路，對(duì)中醫(yī)藥的發(fā)展有重要的推動(dòng)作用[11]。