山竹皮中花青素的提取及純化工藝設(shè)計

魏 琳，樊 琛，于書燕，王 會，鄭煥芹

山竹，屬藤黃科常綠喬木，原產(chǎn)地為馬來半島和馬來群島，其果肉多汁清甜，具有“果中皇后”的美譽。山竹食用后產(chǎn)生的果皮占單果鮮質(zhì)量的52%～68%。山竹皮呈深紫色、性涼、味澀，在泰國等東南亞國家一直作為傳統(tǒng)醫(yī)藥[1]，用于治療腹痛、創(chuàng)傷、痢疾等多種疾病。外果皮含有多種具有收斂作用的多酚類物質(zhì)，包括氧雜蒽酮和單寧酸等，這些物質(zhì)可以起到抗菌作用，也可以入藥[2]。山竹皮中富含抑制、鎮(zhèn)靜作用的單寧，而其中含有的花青素既可以作為營養(yǎng)強化劑又可以作為防腐劑替代合成防腐劑[3]。研究表明，花青素的抗氧化能力是VE的50倍，VC的20倍，是至今為止發(fā)現(xiàn)的較好的天然抗氧化劑之一[2]。此外，它還具有防癌、防治心腦血管疾病、提高免疫力、改善體循環(huán)和抗衰老等多種功效。近年來，高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展使得花青素的研究逐漸成為國內(nèi)外熱點，美國、歐洲諸國等相繼開發(fā)出與花青素相關(guān)的保健品和藥品，花青素在食品營養(yǎng)添加劑、醫(yī)藥保健及化妝品等相關(guān)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[4]。

花青素提取制備方法一般采用水提取、有機溶劑（如乙醇、甲醇等） 提取或采用超聲波提取、酶輔助提取的方法[4-8]。我國有豐富的山竹資源，山竹皮通常被廢棄處理，以山竹皮為材料，提取其中花青素可以提高山竹皮利用率、提高經(jīng)濟價值，也可為花青素的開發(fā)提供新的方向[3-4]。故在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗[5]對山竹果皮中花青素提取工藝進行優(yōu)化，并通過大孔樹脂靜態(tài)吸附進行純化，為山竹皮中花青素的開發(fā)開辟新途徑，實現(xiàn)廢物資源化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

新鮮山竹，購于當(dāng)?shù)厥袌觯笸暾?、無蟲蛀、無霉變。山竹皮烘干（55℃，2 d）至山竹皮質(zhì)量達恒質(zhì)量后粉碎，凍入冰箱，以備后期提取使用。

1.1.2 試劑

無水乙醇、鹽酸（36%）、氫氧化鈉、VC、水溶VE、濃硫酸、鹽酸，均為分析純，蒸餾水。

1.1.3 儀器

ZT-150型高速多功能粉碎機，永康市展凡工業(yè)有限公司產(chǎn)品；DHG-9023A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TS-100B型恒溫搖床，上海天呈試驗儀器制造有限公司產(chǎn)品；UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州翔天實驗儀器廠產(chǎn)品；pH計，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 山竹皮花青素提取

取0.5 g山竹皮粉末，在適宜的提取溫度、料液比、乙醇體積分數(shù)條件下，水浴保溫提取一定時間，取出過濾，定容至25 mL，于波長530，620，650 nm處測其吸光度[5-7]，并計算花青素提取量。

（1）花青素光密度計算。

（2）花青素提取量計算。

式中：E——花青素提取量，nmol/g；

ε——花青素摩爾消光系數(shù)，4.62×104；

V——試樣定容體積，mL；

Aλ——上式光密度；

m——試樣質(zhì)量，g。

1.2.2 花青素提取單因素試驗

（1） 提取溫度對花青素提取量的影響。稱取5份0.5 g的山竹皮粉末，按料液比1∶40（W∶V）加入60%鹽酸乙醇水溶液，于35，50，65，75，85℃的水浴鍋中保溫提取1 h，過濾后定容至25 mL，測其吸光度。

（2）料液比對花青素提取量的影響。量取60%鹽酸乙醇水溶液20 mL，按料液比1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶70（W∶V） 的比例分別加入2.00，1.00，0.50，0.33，0.25 g山竹皮粉末于65℃水浴鍋保溫提取1 h。過濾后定容至25 mL，并測其吸光度。

（3）乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響。稱取5份0.5 g的山竹皮粉末，按料液比1∶40（W∶V）分別加入0，20%，40%，60%，80%的鹽酸乙醇水溶液，于65℃水浴鍋中保溫提取1 h。過濾后定容至25 mL，并測其吸光度。

（4）提取時間對花青素提取量的影響。稱取5份0.5 g的山竹皮粉末，按料液比1∶40（W∶V） 加入60%鹽酸乙醇水溶液，然后將錐形瓶放入65℃的水浴鍋中分別保溫提取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0，12.0 h，過濾后定容至25 mL，并測其吸光度[8-11]。

1.2.3 花青素提取正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行L9（34）正交試驗[12-13]，以提取溫度、料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間4個因素的3水平為試驗變量，以提取液的花青素提取量為評價指標(biāo)，確定山竹皮花青素最佳提取工藝。

1.2.4 大孔樹脂的篩選

選擇4種大孔樹脂D101，X-5，AB-8，HPD-750作為試驗吸附樹脂[14-18]。準(zhǔn)確稱取處理過的不同型號的大孔樹脂1 g，分別加入10 mL已知吸光度A1的花青素粗提液，密封，于25℃，以轉(zhuǎn)速100 r/min振蕩24 h，充分吸附后，過濾，用pH值1.0蒸餾水洗脫除去水溶液雜質(zhì)，并于波長530 nm處測濾液吸光度A2；向大孔樹脂中加入pH值1.0的體積分數(shù)60%乙醇10 mL，于25℃條件下密封，以轉(zhuǎn)速100 r/min搖床振蕩24 h，充分解析后過濾，于波長530 nm處測濾液的吸光度A3。根據(jù)相應(yīng)的公式計算吸附率和解析率。

式中：V1——提取液初始體積，mL；

V2——吸附后濾液體積，mL；

V3——解析后體積，mL。

1.2.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解析研究

（1）花青素粗提液的濃度對吸附量及吸附率的影響。根據(jù)吸附率和解析率，稱取5份1.0 g樹脂，濾紙吸干置于錐形瓶中，取一定量粗提液，稀釋5個梯度，其他步驟同1.2.4，計算吸附量和吸附率。

（2） 大孔樹脂靜態(tài)吸附時間對吸附量的影響。吸附時間1，3，6，9，18，24 h，其他步驟同1.2.4，計算吸附量和吸附率。

（3） 大孔樹脂靜態(tài)解析時間對解析量的影響。解析時間1，3，6，9，18，24 h，其他步驟同1.2.4，計算解析量。

（4）乙醇體積分數(shù)對解析量的影響。解析液選擇30%，45%，60%，75%，90%的乙醇，其他步驟同1.2.4，計算解析量[19-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗對山竹皮花青素的影響

2.1.1 提取溫度對山竹皮花青素的影響

取山竹皮粉末0.5 g，乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶40（W∶V），分別于35，50，65，75，85℃提取溫度下提取1 h。

提取溫度對山竹皮花青素提取量的影響見圖1。

圖1 提取溫度對山竹皮花青素提取量的影響

隨著提取溫度的升高，山竹皮中酶等破壞進而增加了提取液的穩(wěn)定性，使溶液中可溶性成分的溶解度、擴散系數(shù)增大；當(dāng)提取溫度過高，會使不耐熱的有效成分受到破壞進而失活。提取溫度35～85℃時，隨著溫度的升高，山竹皮粉末花青素含量逐漸增加。研究表明，長時間高溫受熱，花青素易發(fā)生聚合，低于或者等于85℃時花青素提取程度遠大于分解程度，但提取的雜質(zhì)含量增高，提取液離開水浴環(huán)境后變渾濁，且溫度過高給后續(xù)操作帶來困難，故正交試驗溫度水平選用65～75℃較合適。

2.1.2 料液比對山竹皮花青素的影響

量取60%鹽酸乙醇水溶液20 mL，按料液比1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80（W∶V） 的比例分別加入對應(yīng)質(zhì)量的山竹皮粉末，于65℃溫度下提取1 h。

料液比對山竹皮花青素提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對山竹皮花青素提取量的影響

一般情況下，只有在料液比較大時花青素提取效果較好。由圖2可知，溶劑用量達到一定程度，隨著料液比的減小，花青素提取量減小，而溶液中花青素含量升高，2條折線有1個交匯點，且料液比過大會造成不必要的溶劑浪費和能源消耗，故料液比選用1∶25～1∶35。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對山竹皮花青素的影響

取山竹皮粉0.5 g，按料液比1∶40（W∶V） 分別加入0，20%，40%，60%，80%的鹽酸乙醇水溶液，于65℃溫度下提取1 h。

乙醇體積分數(shù)對山竹皮花青素提取量的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數(shù)對山竹皮花青素提取量的影響

由圖3可知，隨著鹽酸乙醇水溶液中乙醇體積分數(shù)的升高，山竹皮花青素的提取量增大，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為40%時，達到最大值，但試驗過程中發(fā)現(xiàn)乙醇體積分數(shù)40%時提取液較渾濁，故判斷處于該體積分數(shù)時有其他物質(zhì)的干擾，經(jīng)過比較后選擇50%，60%，70%進行正交試驗。

2.1.4 提取時間對山竹皮花青素的影響

取山竹皮粉0.5 g，按料液比1∶40（W∶V） 加入60%鹽酸乙醇水溶液，分別于65℃的提取溫度提取 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0，12.0 h。

提取時間對山竹皮花青素提取量的影響見圖4。

圖4 提取時間對山竹皮花青素提取量的影響

山竹皮中花青素隨著提取時間的延長，花青素提取量也相應(yīng)增加。由圖4可知，在10 h附近提取率有最大值，而后隨著提取時間的增長，花青素提取量逐漸減少。提取時間較短時，花青素來不及溶出；提取時間過長時，花青素又會因長時間受熱發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，雜質(zhì)成分溶解也隨之增加。故提取時間選擇在9～11 h。

2.2 花青素提取正交試驗

在上述單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間對山竹皮中花青素提取效果的影響，設(shè)計四因素三水平進行正交試驗，即提取溫度優(yōu)化范圍65，70，75℃；料液比優(yōu)化水平1∶25，1∶30，1∶35；乙醇體積分數(shù)優(yōu)化范圍50%，60%，70%；提取時間優(yōu)化水平9，10，11 h。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

表2 正交試驗結(jié)果

由極差值R分析可知，提取溫度對試驗花青素提取率影響程度最大。4個因素對山竹皮中花青素提取效果影響的強弱順序為提取溫度＞料液比＞提取時間＞乙醇體積分數(shù)，最優(yōu)提取因素水平為A3B2C2D3，即山竹皮中花青素的最佳提取條件為提取溫度75℃，料液比1∶30，提取時間11 h，乙醇體積分數(shù)60%。按照正交試驗優(yōu)化的最佳提取工藝進行驗證試驗，測定花青素含量均為2 083.5 nmol/g，故其平均值為2 083.5 nmol/g，高于表3中每一項結(jié)果，故A3B2C2D3為山竹皮花青素的最佳提取工藝。結(jié)果說明由正交試驗所得到的最佳提取工藝是嚴謹?shù)?，結(jié)果是準(zhǔn)確的。

在花青素提取試驗中，王月囡等人[22]采用水浴法提取發(fā)酵后山葡萄皮中的花青素，確定最優(yōu)條件為提取時間1 h，提取溫度65℃，料液比1∶20，乙醇體積分數(shù)50%。張曉南等人[2]利用勻漿機使山竹果皮在乙醇溶液中充分破碎，直接得到提取物中的山竹多酚類物質(zhì)，得出最優(yōu)勻漿時間為6 min。黃雪松等人[24]用分光光度法，以對－二甲基氨基肉桂醛（DMAC） 為顯色劑測山竹殼中原花青素含量，DMAC溶液與兒茶酚反應(yīng)后60 min內(nèi)吸光度測定顯示二者形成的縮合物吸光度在15～35 min內(nèi)比較穩(wěn)定，適宜測量。

2.3 大孔吸附樹脂純化結(jié)果

2.3.1 大孔吸附樹脂的篩選

選取4種不同的大孔樹脂分別對山竹皮花青素進行靜態(tài)吸附和解析試驗。

4種樹脂靜態(tài)吸附及解析結(jié)果見表3。

表3 4種樹脂靜態(tài)吸附及解析結(jié)果

綜合考慮吸附率和解析率2個因素，得出D101型為最佳純化花青素的樹脂。因此，選擇D101大孔樹脂對山竹皮花青素進行吸附和解析試驗。

2.3.2 樣品的濃度對大孔樹脂吸附率和吸附量的影響

樣品的濃度對大孔樹脂吸附率和吸附量的影響見圖5。

圖5 樣品的濃度對大孔樹脂吸附率和吸附量的影響

由圖5可知，D101型樹脂對山竹皮花青素的吸附量和吸附率在一定的濃度范圍內(nèi)隨樣品濃度的增大而增大；但吸附量隨濃度的變化較小，而吸附率隨濃度的變化明顯。當(dāng)相對濃度單位為10時，樹脂的吸附量達到最大，約為60 mg/g；當(dāng)樣品的濃度繼續(xù)增大時，由于樹脂吸附飽和樹脂的吸附率反而下降，此時較高濃度的上樣液會造成原料的浪費，因此在實際生產(chǎn)中應(yīng)控制樣品的相對濃度單位為10為宜。

2.3.3 平衡時間對大孔樹脂吸附量的影響

平衡時間對大孔樹脂吸附量的影響見圖6。

圖6 平衡時間對大孔樹脂吸附量的影響

由圖6可知，在靜態(tài)吸附過程的前1 h內(nèi)D101型大孔樹脂對山竹皮花青素的吸附量迅速增加。1 h后D101型大孔樹脂對山竹皮花青素的靜態(tài)吸附上升并趨于緩慢，由于花青素不穩(wěn)定等因素其吸附量略有下降，因此考慮時間和花青素降解等因素，選取1 h為吸附平衡時間。

2.3.4 平衡時間對大孔樹脂解析量的影響

平衡時間對大孔樹脂解析量的影響見圖7。

圖7 平衡時間對大孔樹脂解析量的影響

由圖7可知，在靜態(tài)解析過程的前1 h內(nèi)D101型大孔樹脂對山竹皮花青素的解析量增加明顯。解析時間在1 h之后，隨著解析時間的增加，D101大孔樹脂對山竹皮花青素的靜態(tài)解析上升趨于緩慢，1 h后基本解析完全，由此，確定1 h為解析平衡時間。

2.3.5 乙醇體積分數(shù)對大孔樹脂解析量的影響

乙醇體積分數(shù)對大孔樹脂解析量的影響見圖8。

圖8 乙醇體積分數(shù)對大孔樹脂解析量的影響

由圖8可知，在乙醇體積分數(shù)30%～60%，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，花青素的解析量隨之減少；在60%之后，解析量隨乙醇體積分數(shù)的增大而增大，在75%時達到最大值，大約為25 mg/g，之后隨乙醇體積分數(shù)的增加而降低，因此，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為75%時對大孔樹脂的解析效果最好。

因此選擇D101型樹脂，在相對濃度單位為10，吸附解析平衡時間均為1 h，乙醇體積分數(shù)為75%時，吸附量為60 mg/g，解析量為25 mg/g。Liu T X等人[25]從山楂中提取原花青素后，用LSA-10型大孔樹脂純化粗提液，上樣質(zhì)量濃度為14.8±0.08 mg/mL，流速為2 BV/h，洗脫液為50%乙醇溶液，洗脫速度為1 BV/h，經(jīng)純化后的原花青素純度可達83.2%。大孔樹脂來源廣泛種類較多，可以提高純化效率且重復(fù)利用，降低試驗成本。但大孔樹脂也存在一定的缺陷,如大孔樹脂需經(jīng)過酸泡、堿泡等一定前處理才能使用，且經(jīng)大孔樹脂純化后的花青素純度不高，還需進行進一步純化處理。試驗中選擇從4種常用大孔樹脂中挑選效果最明顯的一個進行純化試驗，并通過變化樣品濃度，靜態(tài)平衡解析、吸附時間，乙醇濃度確定最優(yōu)條件。

3 結(jié)論

以山竹皮為原料通過單因素試驗和正交試驗確定山竹皮中花青素最優(yōu)提取工藝為提取溫度75℃，料液比1∶30，提取時間11 h，乙醇體積分數(shù)60%，花青素提取量為2 083.5 nmol/g。其中，提取時間、提取溫度、料液比及乙醇體積分數(shù)對花青素的提取量分別具有不同程度的影響，其中以提取溫度對提取過程的影響最為顯著，強弱順序為提取溫度＞料液比＞提取時間＞乙醇體積分數(shù)。

采用D101型大孔樹脂吸附純化，當(dāng)樣品相對濃度10，解析時乙醇體積分數(shù)為75%，靜態(tài)吸附解析時間均為1 h時，吸附量60 mg/g，解析量25 mg/g。其中樣品濃度，靜態(tài)平衡解析、吸附時間，乙醇體積分數(shù)均對山竹皮花青素的純化有較大的影響。