通腑泄熱法對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李偉濤 翟淑萍 章小兵 苑偉 張北平 王百林

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)指在一定條件下，缺血后疏通血管或再造血管使組織得到血液的再灌注不僅不能迅速恢復(fù)正常的代謝機(jī)能，反而引起更嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為組織充血、水腫、組織功能障礙等。其病理生理過(guò)程復(fù)雜, 迄今尚未完全研究清楚。在復(fù)雜的肝臟外科手術(shù)中，肝臟均會(huì)不可避免地、不同程度地IRI，是導(dǎo)致肝切除和肝移植術(shù)后肝功能異常的重要原因[1]。通腑泄熱法是中醫(yī)下法的一種，屬于祛邪法范疇?？烧{(diào)暢臟腑氣機(jī)、給邪氣以出路，達(dá)到泄熱祛邪、恢復(fù)臟腑生理功能的作用[2]。本研究通過(guò)建立肝臟缺血再灌注損傷(liver ischemia reperfusion injury, HIRI)大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)大鼠血清中白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)含量及肝組織勻漿中髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase ，MPO)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性，探討通腑泄熱法中藥對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為HIRI的保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡Sprague-Dawley大鼠(體重250～300 g)150只，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK(粵)2013-0020，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫(22±2)℃，濕度50%～70%，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)新環(huán)境1周。

2.用藥 通腑泄熱法方劑以茵陳蒿湯加減為主，購(gòu)于廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院：茵陳20 g，金銀花15 g，柴胡15 g，黃芩10 g，梔子10 g，大黃10 g，延胡索10 g，白芍10 g，桂枝10 g，黃芪15 g，蒲公英10 g，豬苓10 g，澤瀉15 g，芒硝5 g，每日一劑，水煎100 ml。

3.試劑 IL-6 ELISA試劑盒(批號(hào)CSB-E04640r，武漢華美生物工程有限公司)； CAT測(cè)試盒(批號(hào)A007-1)、MPO測(cè)試盒(批號(hào)A044)，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

4.儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD，型號(hào)：iMark)；低溫離心機(jī) (丹麥Labogene，型號(hào)：Scanspeed 1730R)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏，型號(hào)：DNP-9162)；可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科，型號(hào)：UV752)；電熱恒溫水槽(國(guó)產(chǎn)上海一恒，型號(hào)：DK-8D)。

二、方法

1.分組 根據(jù)隨機(jī)分組原則，將150只大鼠分為缺血再灌注通腑瀉熱方中藥組(TCM組，75只)，缺血再灌注對(duì)照組(Control組，75只)，再分成缺血再灌注后1、3、6 h 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組25只大鼠。自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)1周。

2.建立模型與取材 造模開(kāi)始，每日早8點(diǎn)、晚8點(diǎn)兩次予對(duì)照組大鼠5 ml生理鹽水灌胃，TCM組5 ml通腑泄熱法中藥灌胃，連續(xù)3 d，灌胃后禁食不禁水。將每組大鼠進(jìn)行編號(hào)、稱重。配制1%水合氯醛按照1 ml/100 g劑量進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，參照余淑珍等[3]改良大鼠急性全肝缺血再灌注模型制備方法制備模型。取腹部正中縱切口，上起劍突，顯露肝門，兩組均以無(wú)損傷血管夾阻斷肝門，觀察到肝臟組織顏色由鮮紅逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t，完成30 min阻斷時(shí)間后，松開(kāi)血管夾。用4-0絲線分兩層關(guān)腹。術(shù)后予以電熱毯加熱復(fù)溫。于缺血再灌注后1、3、6 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別對(duì)25只大鼠取材。各亞組每只大鼠每次抽取下腔靜脈血1 ml，取適量肝組織標(biāo)本，制備肝組織勻漿液，離心20 min(3 000 r/min)，收集上清，置于-80 ℃冰箱保存待檢測(cè)。

三、檢測(cè)指標(biāo)

分別以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用IL-6試劑盒定量檢測(cè)大鼠血清IL-6含量、以比色法用CAT試劑盒和MPO試劑盒檢測(cè)肝臟組織勻漿中CAT和MPO含量(嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、兩組大鼠血清中IL-6含量變化

Control組1 h、3 h和6 h各時(shí)間點(diǎn)IL-6含量明顯高于TCM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠肝臟缺血再灌注IL-6含量變化(ng/L)

二、各組大鼠肝臟組織勻漿液中CAT含量變化

Control組大鼠肝臟組織勻漿液中CAT含量在1 h、3 h和6 h時(shí)間點(diǎn)明顯低于TCM組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 大鼠肝臟缺血再灌注后CAT含量變化(U/mgprot)

三、兩組大鼠肝臟組織勻漿液中MPO含量變化

Control組1 h、3 h和6 h各時(shí)間點(diǎn)MPO含量明顯高于TCM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 大鼠肝臟缺血再灌注后MPO含量變化(U/克組織濕重)

討 論

HIRI仍然是肝臟外科的主要問(wèn)題之一，尤其是復(fù)雜的肝臟切除或肝臟移植手術(shù)，需要在控制出血與盡量減少缺血再灌注損傷間尋求平衡。

HIRI是導(dǎo)致肝部分切除術(shù)和肝移植術(shù)后肝功能衰竭的主要原因，減輕術(shù)中HIRI有助于降低手術(shù)對(duì)肝功能的影響[4]，其病理生理過(guò)程復(fù)雜，迄今尚未完全研究清楚。

有研究顯示，缺血再灌注損傷有兩個(gè)階段，即早期階段和晚期階段[5]。早期階段出現(xiàn)在再灌注后6 h內(nèi)，這一階段被認(rèn)為是肝組織快速氧化還原反應(yīng)的結(jié)果[6]。由肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)。而晚期階段主要是由于肝組織中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)和細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[7]。

目前預(yù)防HIRI的方法主要可以歸納為機(jī)械性干預(yù)和藥物干預(yù)，前者主要包括缺血預(yù)處理和缺血后處理[8]。

藥物干預(yù)方面，近年來(lái)，蛋白酶抑制劑、自由基清除劑、鈣通道阻滯劑、某些激素或中藥等均已被證實(shí)可從多種途徑有效抑制HIRI。我們的前期研究證實(shí)中藥對(duì)肝細(xì)胞線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的損傷具有修復(fù)作用，其機(jī)制與修復(fù)肝細(xì)胞mtDNA的表達(dá)有關(guān)[9-11]。

一些中藥具有抗炎和鈣通道阻滯作用，因此也能減輕缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)[12]，不過(guò)許多中藥制劑使用時(shí)必須要濃度較高還要延長(zhǎng)中藥預(yù)處理的時(shí)間[13]，這在一定程度上限制了中藥的臨床推廣使用。

本課題通腑泄熱法方劑以茵陳蒿湯加減為主，茵陳蒿湯出自醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》，不僅可以消退黃疸，而且具有抗肝損傷和肝纖維化的作用[14]。目前臨床上在治療阻塞性黃疸、急性黃疸型肝炎中均有使用，療效良好[15-16]。

茵陳蒿湯的主要有效成分包括蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等[17]。蘆薈大黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和大黃素相似，能顯著抑制肝細(xì)胞及細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛水平的升高，對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用[18]，大黃酚可顯著抑制過(guò)氧化脂質(zhì)的生成，減少組織丙二醛含量[19]，大黃素甲醚能減少氧自由基的產(chǎn)生，減少炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，均可表現(xiàn)出對(duì)損傷的保護(hù)作用。

IL-6既是促炎細(xì)胞因子也是抗炎肌動(dòng)蛋白，在人體中由IL-6 基因編碼[20]。IL-6由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌以刺激免疫應(yīng)答，在多種急慢性炎癥中，如創(chuàng)傷、燒傷、癌癥和感染等情況，體內(nèi)IL-6均會(huì)升高[21]。

MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)。

檢測(cè)血清中IL-6和肝組織勻漿中MPO的含量，可反映出機(jī)體炎癥反應(yīng)程度。本研究結(jié)果顯示：Control組在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)IL-6和MPO水平顯著高于TCM組(P<0.05)，表明通腑泄熱法中藥對(duì)大鼠HIRI的保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制多種炎癥因子釋放、中性粒細(xì)胞黏附和過(guò)度活化有關(guān)。

氧自由基的生成是已知HIRI中最重要的因素之一，有效清除氧自由基，成為減輕缺血再灌注損傷的重要途徑，為減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，目前有多種辦法，一些方法已經(jīng)應(yīng)用于臨床[22]。

CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，防止過(guò)氧化氫在鐵螯合物的作用下與O2反應(yīng)產(chǎn)生破壞性大的羥基自由基，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。

CAT存在于所有已知?jiǎng)游锏母鱾€(gè)組織中，特別在肝臟中以高濃度存在。通過(guò)檢測(cè)肝臟組織勻漿中CAT的活性，可以間接獲知機(jī)體清除過(guò)氧化氫的效率，本研究結(jié)果顯示：Control組在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)CAT含量與TCM組相比明顯下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示通腑泄熱法中藥可提高CAT含量，加速對(duì)氧自由基清除，減輕HIRI。

總之，HIRI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，與肝臟缺血再灌注損傷后多種炎癥因子過(guò)度表達(dá)和氧自由基損害有關(guān)，通腑泄熱法中藥能夠降低HIRI炎癥介質(zhì)釋放，加速氧自由基清除，保護(hù)肝臟損傷。