一種復(fù)合中草藥對草魚非特異性免疫功能的影響

邢玉娟,程安達(dá),呂慧源*,趙志超,王志明,孫艷霞

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一種復(fù)合中草藥對草魚非特異性免疫功能的影響

邢玉娟1,程安達(dá)2,3,呂慧源2,3*,趙志超2,3,王志明2,3,孫艷霞2,3

1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院, 江蘇 泰州 225300 2. 北京生泰爾科技股份有限公司, 北京 102600 3. 北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心, 北京 102600

為研究一種復(fù)合中草藥對魚體非特異性免疫功能的影響，本文采用單因子濃度梯度法，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.05%、0.10%、0.20%的復(fù)合中草藥，以空白飼料組為對照，試驗(yàn)組和對照組各設(shè)3個平行，每個平行為30尾草魚。通過測定血液白細(xì)胞吞噬活性、血清和組織溶菌酶（Lysozyme，LSZ）活力、超氧化物歧化酶（Superoxide dismatase，SOD），評價(jià)草魚非特異性免疫功能。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組草魚白細(xì)胞吞噬能力極顯著高于對照組（<0.01），0.10%組白細(xì)胞吞噬能力顯著高于0.05%組（<0.05）、與0.20%組無顯著差異（>0.05）。0.05%組、0.10%組和0.20%組的血清LSZ活力分別比對照組提高18.63%、28.60%和21.96%（<0.01）。0.10%組肝胰臟的LSZ活力極顯著高于0.05%組和對照組（<0.01），0.20%組顯著高于對照組（<0.05）。3個試驗(yàn)組鰓LSZ活力均極顯著高于對照組（<0.01）。復(fù)合中草藥對血清和肝胰臟的SOD活力無顯著影響。但對草魚鰓SOD活力有顯著影響，0.10%組和0.20%組鰓SOD活力顯著高于對照組（<0.05）。結(jié)論：復(fù)合中草藥可通過提高白細(xì)胞吞噬能力、提高組織溶菌酶（LSZ）及超氧化物歧化酶（SOD）活性來增強(qiáng)草魚的非特異性免疫功能，中草藥為無抗生態(tài)養(yǎng)殖提供了新的思路選擇。

復(fù)合中草藥; 草魚; 非特異性免疫

草魚()是中國重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類[1]，近年來，草魚的病害流行日趨嚴(yán)重，給生產(chǎn)造成了巨大損失。使用抗生素類藥物治療魚病有許多不利因素，如安全性降低及抗藥性增強(qiáng)等，因此，研究和開發(fā)提高草魚抗病力的藥物，尤其是通過飼喂給藥的方式定期進(jìn)行有效的預(yù)防是解決問題的有效辦法。目前，一些學(xué)者研究了單味中草藥對魚類免疫功能及防病能力的影響[2-4]

中草藥毒副作用小，易分解，無殘留，無致癌、致畸、致突變作用，已在我國人、畜和禽上使用多年，效果顯著[5-7]。病害日益嚴(yán)重，為了預(yù)防疾病發(fā)生，篩選對草魚抗病的中草藥免疫增強(qiáng)劑迫在眉睫。目前有研究顯示，中草藥確實(shí)能增強(qiáng)魚類細(xì)胞免疫和體液免疫，從而增強(qiáng)其抗病力。這些工作說明中草藥免疫增強(qiáng)劑在魚類養(yǎng)殖上具有巨大的應(yīng)用前景。

魚類的非特異性免疫應(yīng)答為魚體正常的生理學(xué)反應(yīng)，對魚類的生長、抗病具有重要意義。表征魚體非特異性免疫能力的指標(biāo)很多，如：血清和組織溶菌酶（Lysozyme，LSZ）活力、超氧化物歧化酶（Superoxide dismatase，SOD）活力、白細(xì)胞吞噬能力、抗蛋白酶活力、I型干擾素活力等。與上述指標(biāo)關(guān)聯(lián)的化學(xué)物質(zhì)有LSZ、SOD、抗蛋白酶、轉(zhuǎn)移因子、補(bǔ)體、C-反應(yīng)蛋白、幾丁質(zhì)酶、I型干擾素等，其合成、分泌、發(fā)揮生理作用等環(huán)節(jié)均受到魚類機(jī)體營養(yǎng)狀況的影響。早在1983年人們就開始注意到飼料成分對養(yǎng)殖魚類免疫能力的影響。通過調(diào)整飼料成分[8,9]，改善魚類營養(yǎng)狀況，可以提高養(yǎng)殖魚類免疫功能，減少養(yǎng)殖魚類病害的發(fā)生。

本研究以草魚魚種為實(shí)驗(yàn)對象，在基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合中草藥，研究復(fù)合中草藥對草魚非特異性免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子濃度梯度法，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.00%、0.05%、0.10%、0.20%的復(fù)合中草藥。復(fù)合中草藥由“北京生泰爾科技股份有限公司”提供。成分為黃芪、甘草、板藍(lán)根、大青葉等，規(guī)格100 g/袋，每100 g相當(dāng)于原生藥500 g。以不添加復(fù)合中草藥的基礎(chǔ)飼料組為對照，試驗(yàn)組和對照組各設(shè)3個平行，每個平行為30尾草魚。

1.2 試驗(yàn)飼料

基礎(chǔ)試驗(yàn)飼料用HKJ-219型環(huán)模制粒機(jī)制成=2 mm的硬顆粒，自然晾干，備用。飼料成分及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)草魚來自靖江市濱江水產(chǎn)良種場。將其飼養(yǎng)于12只2.0 m×0.1 m×0.6 m的室內(nèi)水泥池中，隨機(jī)分組。每個水泥池放養(yǎng)30尾草魚，初始體重為108.33±11.26 g。試驗(yàn)采用飽食方式，每天投喂3次（9:00、13:00、17:00）。試驗(yàn)期間水溫為26±2 ℃，各組水質(zhì)完全一致。每周刷洗水泥池1次，防止藻類附著生長。試驗(yàn)周期為60 d，60 d后取樣檢測結(jié)果。

1.4 樣品制備

從每個魚缸隨機(jī)取10尾魚，從尾靜脈取血。其中5尾制備抗凝血，加1%肝素抗凝，4 ℃放置，避免振蕩，防止溶血，另5尾制備血清，將所抽取的全血4 ℃放置5 h，10000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清，-20 ℃保存待測?？鼓糜谘喊准?xì)胞吞噬活性試驗(yàn)，血清用于LSZ活力和SOD活力測定。

將取過血的試驗(yàn)魚立即解剖，剪取肝胰臟和鰓，用預(yù)冷的0.65%生理鹽水沖洗去除血液，剪去肝胰臟表面附著的結(jié)締組織，再用濾紙吸干表面水分，稱重后置于-20 ℃冰箱中保存。測定時(shí)，將樣品解凍，加1倍體積的4 ℃、0.65%的生理鹽水，在冰浴條件下，玻璃勻漿器中勻漿，勻漿液6000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清測定肝胰臟、鰓的LSZ活力和SOD活力。考馬斯亮蘭法測定上述兩種組織的蛋白含量。

1.5 白細(xì)胞吞噬活性測定

1.5.1 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備將金黃色葡萄球菌（）接種于淡水魚類瓊脂培養(yǎng)基(FWA)斜面上，28 ℃培養(yǎng)24 h。用0.65%無菌生理鹽水洗下菌落，用1%福爾馬林、28 ℃滅活24 h，調(diào)整細(xì)菌濃度到1×108CFU/mL，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.5.2 白細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)取0.5 mL抗凝血，加入0.2 mL滅活的金黃色葡萄球菌菌懸液，充分混勻，28 ℃振蕩孵育1 h，然后取上述混合液制備血涂片，自然晾干后滴加甲醇固定10 min，蒸餾水沖洗，Giemsa染色1 h，沖洗，晾干。油鏡觀察并記錄結(jié)果。按照下式計(jì)算吞噬率（Percentage of phagocytosis，）與吞噬指數(shù)（Phagocytic index，）。

（%）=100×(1)

式中為吞噬率；為視野中參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)；為視野中白細(xì)胞總數(shù)。

=(2)

式中為吞噬指數(shù)；為吞噬入白細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)；為參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)。

1.6 血清、肝胰臟和鰓LSZ活力測定

1.6.1 溶壁微球菌菌懸液的制備溶壁微球菌（）凍干粉購自Sigma公司。使用時(shí)，接種于FWA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，傳代3次。然后用0.65%無菌生理鹽水洗下菌落，配制菌懸液，濃度以O(shè)D570約為0.3為最佳。保存于4 ℃冰箱中備用。

1.6.2 LSZ活力測定步驟取2 mL溶壁微球菌菌懸液于試管內(nèi)冰浴10 min，加入0.2 mL血清后混合均勻，立即測定其吸光值1，然后28 ℃水浴條件下精確反應(yīng)15 min（肝胰臟和鰓的勻漿上清液反應(yīng)時(shí)間為45 min），立即進(jìn)行10 min冰水浴，終止反應(yīng)，混勻后在波長570 nm下測定吸光值2。LSZ的活力（U）按下式計(jì)算：LSZ（U）122(3)

1.7 血清、肝胰臟和鰓總SOD活力測定

血清、肝胰臟和鰓總SOD活力測定[10]采用南京建成生物工程研究所的SOD測定試劑盒。SOD活力單位定義為：每毫克組織蛋白的1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為1個活力單位。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5 for windows和EXCEL進(jìn)行one-way ANOVA分析和LSD比較。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SD）表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 草魚白細(xì)胞的吞噬活性

由表2可見，在草魚基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合中草藥，提高了白細(xì)胞的吞噬活性。0.05%復(fù)合中草藥組、0.10%復(fù)合中草藥組和0.20%復(fù)合中草藥組的值極顯著高于對照組（<0.01）。試驗(yàn)組中，0.10%組的值顯著高于0.05%組（<0.05），但和0.20%組無顯著差異（>0.05）。0.05%組和0.20%組的值無顯著性差異（>0.05）。飼料中添加復(fù)合中草藥對白細(xì)胞的無顯著性影響（>0.05）。

表2 草魚血液白細(xì)胞的吞噬活性

備注：同一行大寫字母不同表示差異極顯著（<0.01）,小寫字母不同表示差異顯著（<0.05）。下同。

Note: Capital in each column with difference is extremely significant (<0.01), lowercase letter differences indicate significant differences (<0.05).The same below.

2.2 復(fù)合中草藥對血清、肝胰臟和鰓LSZ活力的影響

復(fù)合中草藥能顯著提高草魚血清、肝胰臟和鰓中的LSZ活力（表3）。

0.05%組、0.10%組和0.20%組的血清LSZ活力較對照組分別提高18.63%、28.60%和21.96%（<0.01）。3個試驗(yàn)組相比較，0.10%組血清LSZ活力顯著高于0.20%組（<0.05）、極顯著高于0.05%組（<0.01），而0.05%組和0.20%組之間無顯著差異（>0.05）。

肝胰臟中LSZ活力變化趨勢和血清中LSZ活力變化趨勢基本一致。0.10%組肝胰臟的LSZ活力最高，極顯著高于0.05%組和對照組（<0.01），與0.20%組無顯著差異（>0.05）。0.20%組肝胰臟LSZ活力顯著高于對照組（<0.05），和0.05%組無顯著差異（>0.05）。

3個試驗(yàn)組鰓LSZ活力均極顯著高于對照組（<0.01）。0.10%組鰓LSZ活力較0.05%組顯著提高（<0.05），和0.20%組無顯著差異（>0.05）。0.05%組和0.20%組鰓LSZ活力無顯著性差異（>0.05）。

表3 草魚血清、肝胰臟和鰓LSZ活力/U

2.3 復(fù)合中草藥對血清、肝胰臟和鰓SOD活力的影響

由表4可見，添加復(fù)合中草藥對血清和肝胰臟的SOD活力無顯著性影響（>0.05）。復(fù)合中草藥對鰓SOD活力有顯著影響，其中0.10%組、0.20%組鰓SOD活力顯著高于對照組（<0.05），但0.05%組與對照組鰓SOD活力無顯著差異（>0.05）。0.05%組、0.10%組和0.20%組三組之間無顯著差異（>0.05）。

表4 草魚血清、肝胰臟和鰓SOD活力

3 討論

魚類血液中具有吞噬能力的白細(xì)胞主要有粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞[11]。魚類的粒細(xì)胞可分為嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。但是，不是所有的魚類都同時(shí)具有這3種粒細(xì)胞。單核細(xì)胞存在于所有硬骨魚血液中。魚類的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞可釋放與哺乳動物的Ⅰ-Ⅱ型白細(xì)胞介素和轉(zhuǎn)移因子相似的物質(zhì)。魚體白細(xì)胞在消化病原生物的同時(shí)可保留有關(guān)抗原信息并且將其傳遞給相關(guān)的淋巴細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。

本研究復(fù)合中草藥的使用可以提高草魚血液中白細(xì)胞的吞噬能力，王吉橋[12]等在牙鲆上的研究也得到類似的結(jié)果，雖然中草藥的種類以及魚的種類都不同，但說明有些中草藥確實(shí)發(fā)揮了一定的作用。其原因可能是飼料中添加復(fù)合中草藥，改善了草魚體內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高了草魚的營養(yǎng)水平，進(jìn)而改善了魚體的免疫狀態(tài)，提高了機(jī)體免疫水平，相應(yīng)地提升了白細(xì)胞的吞噬能力。

LSZ是魚體內(nèi)重要的非特異性防御因子，是魚體生理防御水平的重要標(biāo)志。LSZ是一種堿性水解酶，主要作用于細(xì)菌細(xì)胞壁粘多糖的-1,4糖苷鍵，同時(shí)對真菌、寄生物以及病毒也有破壞作用。因此，它在魚類抵抗傳染性疾病時(shí)起著重要作用。魚體中LSZ的產(chǎn)生與哺乳動物相似，主要由嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，少量由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。LSZ在魚的粘液、血清、相關(guān)免疫器官及腸、鰓、肝、胃等組織中廣泛分布，其活力受遺傳、溫度、食性等諸多因素的影響。血清與肝胰臟在魚體內(nèi)識別外來異物及免除異物侵害中發(fā)揮著重要作用，而鰓是病原體進(jìn)入體內(nèi)的通道，故鰓LSZ的主要功能是阻止病原入侵。

本試驗(yàn)在草魚飼料中適量添加復(fù)合中草藥，能提高肝胰臟、血清、鰓LSZ活力?？赡芤彩且?yàn)閺?fù)合中草藥能提高草魚的消化吸收能力，特別是提高了魚體對脂肪、蛋白質(zhì)及其它營養(yǎng)成分的利用率，另外，血液中白細(xì)胞吞噬能力的提高是導(dǎo)致LSZ活力提高的另一個重要原因。

自1969年Mccord和Fridovich報(bào)道SOD的酶學(xué)特性以來，以SOD為中心的生物活性氧代謝研究進(jìn)展很快，迄今已形成了生物活性氧傷害學(xué)說。SOD屬于金屬蛋白酶，主要分布于胞漿和線粒體的基質(zhì)中。是生物體內(nèi)清除活性氧，防止生物分子損傷，免受細(xì)胞氧化傷害的關(guān)鍵酶之一。機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切關(guān)系，該防御體系包括酶促和非酶促兩個體系，SOD是酶促體系的重要組成部分。SOD能夠阻斷脂質(zhì)過氧化作用，是抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵性酶，也是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，其活力受O2-的調(diào)控。

草魚代謝過程中，機(jī)體會產(chǎn)生大量的O2-和H2O2等活性氧，這些活性氧具有一定的殺菌作用，同時(shí)也對動物體本身有毒害作用，需要SOD及時(shí)清除。飼料中添加復(fù)合中草藥后，發(fā)現(xiàn)其鰓部的SOD活力顯著提高，可以更好的清除體內(nèi)的自由基，改善機(jī)體的健康狀況。

綜上，在草魚基礎(chǔ)飼料中適量添加復(fù)合中草藥，可以一定程度地提高草魚機(jī)體的非特異免疫水平，主要表現(xiàn)在草魚機(jī)體白細(xì)胞吞噬能力的提高，LSZ活力的提高以及草魚鰓部抗氧化機(jī)能的提高這幾個方面。其機(jī)理還有待探索，但不影響其作為一種新型的飼料添加劑應(yīng)用到飼料中，來增加魚體的抗病能力。中草藥的合理應(yīng)用為無抗生態(tài)養(yǎng)殖，提供一種可供選擇的思路。

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Effects of a Compound Chinese Herbal Medicine on Nonspecific Immune Function of

XING Yu-juan1, CHENG An-da2,3, LV Hui-yuan2,3*, ZHAO Zhi-chao2,3, WANG Zhi-ming2,3, SUN Yan-xia2,3

1.225300,2.102600,3.102600,

In order to study the influence of a compound Chinese herbal medicine on the nonspecific immune function of, experiments were conducted using single factor concentration gradient method. 0.05%, 0.10% and 0.20% of compound Chinese herbal medicine were added to the basic feed. The blank feed group was taken as the control group, and 3 parallel groups were set for each group, with 30 tails grass carp in each group. The nonspecific immune function of grass carp was evaluated by measuring the phagocytic activity of blood leukocytes, the activity of serum and tissue lysozyme (Lysozyme, LSZ) and superoxide dismutase SOD). Results: The phagocytic ability of grass carp leukocytes in the experimental group was significantly higher than that in the control group (<0.01), the phagocytosis of leukocytes in 0.10% group was significantly higher than that in 0.05% group (<0.05), but there was no significant difference between 0.20% group (>0.05). Compared with the control group, the serum LSZ activity in group 0.05%, 0.10% and 0.20% increased by 18.63%, 28.60% and 21.96% (<0.01) respectively. LSZ activity of liver pancreas in 0.10% group was significantly higher than that in 0.05% group and control group (<0.01),and that in the 0.20% group was significantly higher than that in the control group (<0.05), the activity of gill LSZ in 3 experimental groups was significantly higher than that of control group (<0.01). There was no significant effect of compound Chinese herbal medicine on SOD activity of serum and liver pancreas. However, the SOD activity of gill in 0.10% and 0.20% group was significantly higher than that in the control group (<0.05). Conclusion: Compound Chinese herbal medicine can enhance the nonspecific immune function of grass carp by increasing the phagocytic ability of leukocytes and the activities of tissue lysozyme (LSZ) and superoxide dismutase (SOD). Chinese herbal medicine provides a new way of thinking for non-resistant ecological cultivation.

Compound of Chinese herbal medicine;;nonspecific immune.

S965.112

A

1000-2324(2018)05-0782-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.05.011

2017-01-10

2018-01-10

邢玉娟(1964-),女,大學(xué)本科,副教授,主要從事動物醫(yī)學(xué)臨床教學(xué)與實(shí)踐. E-mail:1903048595@qq.com

通訊作者:Author for correspondence.E-mail:lvhuiyuan0507@163.com