刺茶美登木抑菌活性成分研究

劉彥超，黑育榮，田 進(jìn)

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌712100）

衛(wèi)矛科（Celastraceae）植物有著悠久的民間藥用資源歷史。衛(wèi)矛科美登木屬（Maytenus）植物，全球共有300多種，分布在我國(guó)的有20種左右[1]，該屬植物富含三萜[2-3]、倍半萜[4]、生物堿[5-6]、黃酮及其苷類(lèi)[7-8]、酚類(lèi)[9]等。在民間，美登木屬植物被廣泛用作抗敗血病、抗腫瘤、抗炎、催涎、治療消化道疾病、哮喘、風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕等疾病的藥物[2-5，10]。

美登素，從結(jié)構(gòu)上看屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，作為一種天然抗腫瘤活性成分，其在20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)，吸引了科研工作者對(duì)美登木屬植物活性成分的研究，如布昌南美登木（Maytenus buchananii）[7]、云南美登木（Maytenus hookeri）[8]、細(xì)梗美登木（Maytenus graciliramula）[9]、廣西美登木（Maytenus guangsiensis）[10]、密花美登木（Maytenus confertiflorus）[11-12]、刺茶美登木（Gymnosporia varialilis）[13]等，取得了重要的研究進(jìn)展。隨著美登素的廣泛臨床使用，其副作用也逐漸呈現(xiàn)出來(lái)，一系列的不良反應(yīng)致使對(duì)美登素的相關(guān)研究工作也一度停止。20世紀(jì)90年代之后，由于美登木屬植物表現(xiàn)出顯著的抗菌、昆蟲(chóng)拒食活性、抗炎、抗HIV等多方面的生物活性，重新進(jìn)入了科研工作者的視野。

MONACHE等[14]于 1984年從 Maytenus rigida中分離到顯示昆蟲(chóng)拒食作用的生物堿類(lèi)化合物，以此為開(kāi)端，有關(guān)美登木屬植物中昆蟲(chóng)拒食活性成分陸續(xù)被報(bào)道[15-17]。近年來(lái)，隨著美登木屬植物化學(xué)成分及生物活性相關(guān)研究工作的深入，新的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)型和具有多種生物活性的先導(dǎo)化合物不斷被發(fā)現(xiàn)，如細(xì)胞毒[11]、HIV-1 蛋白酶抑制[8]、抗炎[12]等方面的活性。

李炳鈞等[13]于1983年從刺茶美登木（Gymnosporia varialilis）中分離出3個(gè)生物堿類(lèi)化合物，分別是美登普林（maytanprine）、美登新（maytansine）和美登布?。╩aytanbutine），活性測(cè)試結(jié)果顯示，其均具有強(qiáng)烈的抗癌活性。

2005年，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所對(duì)它的乙醇提取物進(jìn)行活性篩選后發(fā)現(xiàn)，它具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制活性，為了闡明刺茶美登木提取物中具有ACE抑制活性的物質(zhì)，對(duì)其地上部分的95%乙醇提取物進(jìn)行了系統(tǒng)地分離，從中共分離純化并鑒定了30個(gè)化合物，其中，（+）-兒茶素和咖啡酸是抑制ACE的活性成分[18]。

本研究對(duì)刺茶美登木的乙醇提取物進(jìn)行抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)了它具有抑制油菜菌核、小麥雪腐、小麥根腐、水稻白葉枯、白菜軟腐、獼猴桃潰瘍生長(zhǎng)的活性。并采用活性跟蹤法對(duì)提取物進(jìn)行了分離純化，最終獲得2個(gè)化合物，即Tanegool和Prinsepiol，其中，化合物Tagenool具有較強(qiáng)的抑菌活性。本研究旨在為將刺茶美登木開(kāi)發(fā)成植物源殺菌劑奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

刺茶美登木地上部分采自四川省攀枝花市，標(biāo)本由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院李琰副教授鑒定，憑證標(biāo)本（標(biāo)本號(hào)No.P-22）保存在楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院標(biāo)本室。

1.2 供試菌種

煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）、楊樹(shù)潰瘍病菌（Dothiorella gregariaSacc.）、棉花枯萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）、 水 稻 紋 枯 病 菌（Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk.）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae（Berk.）Sacc.）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealisVander Hoeven）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、玉米小斑病菌（Bipolaria maydis）、番茄早疫病菌（Alternaria solani（Ellis et Martin）Jones et Grout.）、黃瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum Schlecht）、棉花黃萎病菌（Verticilliumdahliae）、蘋(píng)果炭疽病菌（Glomerella cingulata（Stoneman）Spauld.et Schrenk）、番茄葉霉病菌（Fulvia fulva（Cooke）Ciferri）、番茄灰霉病菌（Botrytiscirerea Pers Fr.）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）、棉花立枯病菌（Rhizoctoniasolani）、小麥赤霉病菌 （Gibberella zeae（Schw.）Petch）、蘋(píng)果輪紋病菌（Botryosphaeriaberengriana f.sppiricola）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsiciLeonian）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzaeCav.）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、小麥白粉病菌（Blumeriaa graminis）、小麥根腐病菌（Bipolarissorokiniana）。以上菌種均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：將洗凈后的土豆去皮并切片，于鍋中加1 000 mL水和200 g已切好的土豆片，燒開(kāi)后保持沸騰約30 min，之后用紗布過(guò)濾，再加適量的水將濾液補(bǔ)足至1 000 mL，并倒入干凈的鍋中，再加入10 g瓊脂和20 g葡萄糖，再次煮沸，待瓊脂和葡萄糖全部溶解后，停止加熱，趁熱將培養(yǎng)基分裝于250 mL的三角瓶中，封口，于滅菌鍋中滅菌30 min（121℃）。

1.4 主要儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司，W501B）；超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，SB25-12DT）；干燥箱（北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司，科偉101-1）；粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司，F(xiàn)-160）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，SHB-B95A）；全自動(dòng)型鼓風(fēng)干燥箱（上海智域分析儀器制造有限公司，ZRD-5030）；三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠，ZF-2）；玻璃儀器氣流烘干器（鞏義市莫峪予華儀器廠，KQ-C）；薄層板（自行鋪制的25 mm×75 mm及50 mm×100 mm的薄層板）；各種規(guī)格的層析柱；工業(yè)純?cè)噭?5%工業(yè)乙醇、石油醚（60～90℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等試劑；分析純?cè)噭菏兔?、丙酮等試劑；硅膠：0.15～0.18（拌樣硅膠），0.049～0.075 mm（柱層析硅膠），GF-254型薄層層析硅膠；顯色劑為10%硫酸乙醇顯色劑和碘顯色劑等。

1.5 方法

1.5.1 活性物質(zhì)的提取分離純化 在活性跟蹤的基礎(chǔ)上采用有機(jī)溶劑萃取、反復(fù)柱層析、重結(jié)晶等技術(shù)對(duì)刺茶美登木中的抗菌活性成分進(jìn)行分離純化。

1.5.2 活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定 采用波譜學(xué)方法對(duì)單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.5.3 抑菌活性測(cè)定 抑制菌絲生長(zhǎng)速率法：采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定刺茶美登木95%乙醇提取物對(duì)植物病原真菌的離體活性。把95%乙醇提取物配制成待測(cè)供試藥液（溶劑為分析純丙酮），將供試藥液與已融化的培養(yǎng)基按1∶9（V∶V）的比例混合均勻，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，制成帶毒平板，以溶劑為空白對(duì)照。用打孔器（直徑為4 mm）將病原真菌打成大小一致的菌餅，接入帶毒培養(yǎng)基的中央，每皿接1個(gè)菌餅，設(shè)3個(gè)重復(fù)，將轉(zhuǎn)接過(guò)的菌種置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，之后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.5.4 提取物初步活性測(cè)定 將粉碎后的刺茶美登木植物樣品的95%乙醇提取物減壓蒸干后配成500 mg/mL的丙酮溶液，置于4℃冰箱中冷藏，使用前稀釋到所需濃度即可。以丙酮處理為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按1.3.3方法對(duì)供試植物病原菌進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速率抑制率的測(cè)定。

1.5.5 活性物質(zhì)的分離與純化 自然風(fēng)干并粉碎后的刺茶美登木（G.varialilis）的全草（1 kg）在室溫下用95%工業(yè)乙醇浸泡21 d（每次7 d，共3次，5 L×3），合并總浸出物，采用減壓濃縮得到總浸膏共40 g。將總浸膏分散于1.5 L的50℃熱水中，依次用石油醚（1.5 L×5）、乙酸乙酯（1.5 L×5）萃取，萃取液分別濃縮得浸膏A（石油醚萃取物，6.4 g）、B（乙酸乙酯萃取物，8 g）和C（水相，未稱質(zhì)量）?？咕钚陨餃y(cè)定結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物B顯示出較強(qiáng)的活性，因此，對(duì)乙酸乙酯萃取物進(jìn)行了進(jìn)一步的分離純化，以石油醚-丙酮（10∶1）為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析（柱長(zhǎng)30 cm，內(nèi)徑5 cm），通過(guò)TLC分析合并得到5個(gè)組分BA1～BA5，其中，BA2為活性部位。BA2放置1 d后有白色針狀晶體析出，經(jīng)過(guò)重結(jié)晶處理，得到化合物2。BA2的母液進(jìn)一步采用硅膠柱層析進(jìn)行分離，并結(jié)合制備TLC和重結(jié)晶技術(shù)，得到化合物Tanegool。

1.5.6 活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定 經(jīng)TLC檢驗(yàn)，在石油醚∶丙酮（10∶1），氯仿∶丙酮（20∶1）和氯仿∶甲醇（50∶1）3種展開(kāi)體系中，化合物Tanegool和Prinsepiol均為單一斑點(diǎn)；經(jīng)熔點(diǎn)測(cè)定，Tanegool和Prinsepiol的熔點(diǎn)分別為138.2～140.1，122.2～123.4℃，熔點(diǎn)尖銳，熔程短。

根據(jù)以上檢驗(yàn)結(jié)果，初步判斷化合物Tanegool和Prinsepiol均為純品。與已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC多體系對(duì)照，Rf值均保持良好的一致性，通過(guò)核磁共振氫譜和碳譜（1H-NMR，13C-NMR）最終鑒定這2種化合物分別為T(mén)anegool和Prinsepio（l結(jié)構(gòu)式如圖1所示）。

1.5.7 活性成分梯度活性測(cè)定 將化合物Tanegool配制成 5 個(gè)濃度梯度 1.00，0.80，0.60，0.40，0.20 mg/mL，以丙酮處理為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按1.3.3方法對(duì)油菜菌核病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌3種植物病原菌進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定。8 d后測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺茶美登木95%乙醇提取物對(duì)植物病原真菌的抑制活性

從表1可以看出，刺茶美登木95%乙醇提取物在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)油菜菌核病菌、番茄早疫病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌的抑制作用較強(qiáng)，抑制率在75%以上，對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌、水稻稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌表現(xiàn)出一定程度的抑制活性，抑制率在40%～75%，對(duì)白菜黑斑病菌、蘋(píng)果炭疽病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、棉花黃萎病菌和小麥紋枯病菌的抑制率均在20%以下。

表1 刺茶美登木95%乙醇提取物對(duì)植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 單體化合物對(duì)供試病原菌的抑制活性

刺茶美登木95%乙醇提取物依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取后得相應(yīng)浸膏，對(duì)抑菌活性較強(qiáng)的乙酸乙酯萃取段進(jìn)行反復(fù)柱層析，并結(jié)合重結(jié)晶處理，獲得2個(gè)單體化合物。通過(guò)TLC檢驗(yàn)、熔點(diǎn)測(cè)定，并結(jié)合1H-NMR和13C-NMR波譜數(shù)據(jù)，分別鑒定為T(mén)anegool和Prinsepiol。測(cè)定了化合物Tanegool和Prinsepiol對(duì)以上植物病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用。從表2可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，化合物Tanegool對(duì)油菜菌核病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用，而化合物Prinsepiol在同樣的濃度下，對(duì)番茄早疫病菌有一定的抑制作用，對(duì)其余植物病原菌抑制效果較弱，甚至不表現(xiàn)出活性。圖2顯示的抑菌圈大小也驗(yàn)證了化合物Tanegool對(duì)以上3種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)弱。

表2 Tanegool和Prinsepiol對(duì)幾種植物病原真菌的抑制活性

2.3 不同濃度的Tanegool在對(duì)植物病原真菌菌絲的生長(zhǎng)抑制

由表3可知，Tanegool對(duì)3種植物病原菌的抑制效果與濃度呈正相關(guān)。質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制率最高，可達(dá)到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)的6倍，最低為3.33倍，這表明，對(duì)植物病原真菌菌絲的生長(zhǎng)作用表現(xiàn)出濃度依賴性。

表3 Tanegool在不同濃度下對(duì)植物病原真菌的抑制作用

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)刺茶美登木乙醇提取物的抑菌活性成分進(jìn)行跟蹤分離，獲得2個(gè)化合物（Tanegool和Prinsepiol），在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，Tanegool對(duì)油菜菌核病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌具有較好的生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)西瓜枯萎病菌效果尤為明顯。Prinsepiol未表現(xiàn)出活性。

另外，Tanegool對(duì)以上3種植物病原菌的抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，各濃度間對(duì)植物病原菌的抑制作用有的差異很大，有的無(wú)顯著差異，其對(duì)真菌的抑制作用強(qiáng)度值得進(jìn)一步驗(yàn)證。

經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)解析，Tanegool和Prinsepiol都屬于木脂素類(lèi)化合物，此類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗病毒、保護(hù)肝臟、抗氧化、血小板活化因子拮抗活性、抗炎抗菌等作用[19-20]。如西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心從砂地柏中提取的木脂素類(lèi)化合物鬼臼毒素具有拒食殺蟲(chóng)活性；KAWAZOE等[21]從馬鞭草科蔓莖植物的果實(shí)中分離得到4種抗菌活性的木脂素vitrofolal B，C，D，E。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，刺茶美登木中含有多種木脂素類(lèi)化合物，此次研究發(fā)現(xiàn)，Tanegool具有較高的抑制植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的活性?；衔颬rinsepiol雖然在本試驗(yàn)中顯示較弱的抑制植物病原菌活性，但其在該植物中含量較高，若能對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)改造以提高活性，將對(duì)刺茶美登木作為原料開(kāi)發(fā)植物源殺菌劑具有重要的意義。

本研究結(jié)果為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)刺茶美登木殺菌活性成分提供了一定的參考，為將刺茶美登木開(kāi)發(fā)成植物源殺菌劑提供了一個(gè)良好的開(kāi)端。