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    金剛藤總黃酮分離純化工藝研究

    2018-10-20 08:10:48況成裕殷成強(qiáng)劉大勇龍玉波王玉環(huán)
    食品與藥品 2018年5期
    關(guān)鍵詞:金剛大孔藥液

    況成裕,殷成強(qiáng),劉大勇,龍玉波,王 振,王 芳,王玉環(huán)

    (1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250101;2. 山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司,山東 濟(jì)南 250104)

    金剛藤為百合科植物菝葜(Smilax chinaL.),又名金剛刺、假萆解[1],廣泛分布于長江以南丘陵地區(qū),藥用其根莖。其性甘溫?zé)o毒,有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,金剛藤有抗感染與鎮(zhèn)痛[2]、抗腫瘤作用[3]、活血和增強(qiáng)免疫作用[4]?,F(xiàn)代臨床研究表明,金剛藤在治療輸卵管梗阻性不孕[5]、繼發(fā)性不孕癥[6]、慢性盆腔炎[7]等方面有較好療效。

    國內(nèi)外學(xué)者在金剛藤屬植物的生物活性及化學(xué)成分研究中取得一定成果[8-9],研究表明,金剛藤中含有山萘酚、山萘酚-7-O-β-D-吡喃葡糖苷、二氫山萘酚、槲皮素-3-O-葡糖苷、槲皮素、異鼠李素、落新婦苷、新異落新婦苷、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷、黃杞苷等多種黃酮類化合物。其中落新婦苷含量較高,且生物活性較強(qiáng),具有心血管活性、免疫抑制、減輕腎功能損傷、保肝等作用[10-12]。

    黃酮化合物生物活性眾多,經(jīng)提取純化,可充分發(fā)揮其在醫(yī)藥方面的作用。而金剛藤總黃酮的分離純化尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)篩選6種不同型號的大孔吸附樹脂純化金剛藤黃酮,并通過動態(tài)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化LS-303型大孔樹脂純化工藝,為尋找該植物有效成分,更好地開發(fā)利用其資源提供參考。

    1 儀器和材料

    1.1 儀器

    8453型紫外-可見分光光度儀(Agilent),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELAOSB0-2100),玻璃層析柱(直徑1.5,2,2.5 cm)。

    1.2 試藥與試劑

    金剛藤藥材,2015年8~9月采集于貴州開陽縣、修文縣和四川安岳縣,經(jīng)鑒定為百合科植物菝葜(Smilax chinaL.)的根莖,洗凈,切片,曬干;落新婦苷對照品(自制,含量97.82 %),甲醇、乙醇為分析純,水為純化水;大孔吸附樹脂LS-46D、LSA-40、LS-300B、LS303、D101、AB-8(陜西藍(lán)深特種樹脂公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 總黃酮含量測定方法

    2.1.1 對照品溶液制備 稱取干燥至恒重的落新婦苷對照品(含量97.82 %)5 mg,精密稱定(5.09 mg),置入50 ml量瓶,加乙醇20 ml,超聲使溶解,加乙醇至刻度,搖勻,制成濃度為0.0996 mg/ml對照品溶液[13]。

    2.1.2 供試品溶液制備 藥材供試品溶液:稱取金剛藤細(xì)粉(過40目篩)0.3 g,精密稱定,置入250 ml圓底燒瓶,加乙醇100 ml,稱定重量,加熱回流提取1 h,放冷,加乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為藥材供試品溶液。

    浸膏供試品溶液的制備:稱取金剛藤藥材500 g,加水5 kg,加熱回流提取2次,每次時(shí)間1.5 h,合并提取液,濾過,濃縮至500 ml,放冷,邊攪拌邊加入95 %乙醇1400 ml,繼續(xù)電動攪拌15 min,靜置24 h,濾過,濾液回收乙醇,減壓濃縮至約250 ml,放冷,得浸膏。稱取浸膏0.1 g,精密稱定,置入100 ml量瓶,加乙醇40 ml,超聲30 min,放冷,加乙醇至刻度,搖勻,7000 r/min離心10 min,取上清液作為浸膏供試品溶液。

    上樣藥液、吸附后濾液、洗脫液(見2.3、2.4、2.8項(xiàng)下制備所得)供試品溶液的制備:稱取上樣藥液0.2 g、吸附后濾液0.5 ml、洗脫液供試品溶液0.5 ml,精密稱定,分別置入100 ml量瓶,加乙醇40 ml,超聲30 min,放冷,加乙醇至刻度,搖勻,7000 r/min離心10 min,分別取上清液作為供試品溶液。

    總黃酮提取物供試品溶液:稱取總黃酮提取物細(xì)粉25 mg,精密稱定,置100 ml量瓶中,加乙醇40 ml,超聲30 min,放冷,加乙醇至刻度,搖勻,7000 r/min離心10 min,取上清液作為總黃酮提取物供試品溶液。

    2.1.3 檢測波長選擇 精密量取對照品溶液、藥材供試品溶液和總黃酮提取物供試品溶液各1 mL,置入10 mL量瓶,加乙醇至刻度,搖勻,以乙醇為空白,在波長200~400 nm范圍內(nèi)掃描,對照品溶液、藥材供試品溶液和總黃酮提取物供試品溶液均在292 nm處有最大吸收峰,因此選擇292 nm作為檢測波長。

    2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對照品溶液0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,2.4 ml,分別置入10 ml量瓶,292 nm處測定吸光度,以濃度C為橫坐標(biāo),以吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A=31.69C+0.053,R2=0.9993。結(jié)果表明,落新婦苷在3.98~23.90 μg/ml濃度范圍之內(nèi)呈良好的線性關(guān)系

    2.1.5 測定 精密量取供試品溶液1 ml,置入10 ml量瓶,加乙醇至刻度,搖勻,292 nm處測定吸光度,計(jì)算總黃酮含量。

    2.2 上樣藥液制備

    稱取金剛藤藥材500 g,加水5 kg,加熱回流提取2次,每次時(shí)間1.5 h,合并提取液,濾過,濃縮至500 ml,放冷,邊攪拌邊加入95 %乙醇1400 ml,繼續(xù)電動攪拌15 min,靜置24 h,濾過,濾液回收乙醇,減壓濃縮至約250 ml,放冷,邊攪拌邊加入純化水至相對密度為1.10(20 ℃),2~4 ℃靜置24 h,抽濾,即得上樣藥液(約500 ml)。

    2.3 靜態(tài)吸附法篩選大孔吸附樹脂型號

    取上樣藥液5份,每份100 ml,分別置入裝有經(jīng)預(yù)處理各種型號樹脂20 g的250 ml具塞三角瓶[14-15],每30 min振搖1次,每次30 s,持續(xù)3 h,靜置過夜,濾過,取續(xù)濾液0.5 ml至10 ml量瓶,加乙醇至刻度,搖勻,于292 nm處測定吸光度,計(jì)算吸附率。樹脂抽濾至干,用70 %乙醇200 ml解吸,操作同上,濾過,得靜態(tài)洗脫液,測吸光度,計(jì)算解吸率,結(jié)果見表1。

    由表1可見,吸附率、解吸率相對較高的為LS303,其優(yōu)勢明顯,故選擇LS303型樹脂進(jìn)一步優(yōu)化工藝。

    表1 不同型號樹脂靜態(tài)吸附率及解析率結(jié)果

    2.4 靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附的比較研究

    取上樣藥液100 ml,按2.3項(xiàng)下方法操作,測定吸附率和解析率。

    取上樣藥液100 ml,加至預(yù)處理合格的大孔吸附樹脂柱(LS-303,20 g,直徑1.5 cm),流速1 BV/h,收集吸附后濾液,攪勻,按2.2項(xiàng)下要求測定總黃酮含量,計(jì)算吸附率。加70 %乙醇200 ml至樹脂柱,攪勻,洗脫,流速1 BV/h,收集洗脫液,攪勻,按2.2項(xiàng)下要求測定總黃酮含量,計(jì)算解析率。結(jié)果見表2。由表2可見,動態(tài)吸附方式的吸附率高于靜態(tài)吸附。

    表2 大孔吸附樹脂靜、動態(tài)吸附率及解析率結(jié)果

    2.5 泄露曲線繪制

    取預(yù)處理樹脂20 g(體積28 ml),裝柱(直徑1.5 cm)。取上樣藥液(45.33 mg/ml)300 ml,以1 BV/h流速上樣。收集流出液,每份28 ml。測定總黃酮含量,以總黃酮含量為考察指標(biāo)繪制泄漏曲線,結(jié)果見圖1。

    由圖1可見,當(dāng)上樣吸附84~112 ml(4 BV)時(shí),開始有泄漏,故暫定吸附終點(diǎn)為總黃酮/樹脂=5.14:20。

    圖1 初步確定吸附終點(diǎn)的泄露曲線

    2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)選大孔吸附樹脂柱吸附工藝

    2.6.1 因素及水平考察 根據(jù)單因素探索性試驗(yàn)結(jié)果,取樹脂20 g(28 ml),選擇上樣藥液濃度、吸附流速、樹脂柱高度等3個(gè)因素,每個(gè)因素選擇3個(gè)水平,設(shè)定因素水平,見表3。

    表3 大孔樹脂吸附工藝因素水平

    2.6.2 取金剛藤藥材細(xì)粉,按2.2項(xiàng)下要求制備上樣藥液3批,按L9(34)正交表設(shè)計(jì)方案分別取80 ml,加至預(yù)處理合格的大孔吸附樹脂柱,進(jìn)行吸附,吸附結(jié)束后,測定吸附后濾液中總黃酮含量,計(jì)算吸附率;取200 ml 70 %乙醇加至樹脂柱中,攪拌均勻,排凈氣泡,進(jìn)行洗脫,洗脫流度均為1 BV/h,洗脫液濃縮、干燥,測定總黃酮含量,測定結(jié)果及方差分析結(jié)果見表4。

    由表4可見,考慮吸附率最佳工藝均為A3B2C1;考慮提取物總黃酮含量最佳工藝均為A3B2C2。由方差分析可見,樹脂柱高徑比對吸附率有顯著影響,上樣藥液含量對提取物含量有顯著影響。綜合考慮耗能等因素,最佳工藝定為A3B2C2,即上樣藥液濃度45.81 mg/ml、吸附流速1 BV/h、樹脂柱徑高比8.9:2。

    表4 篩選動態(tài)吸附參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果

    2.7 重新確定吸附終點(diǎn)

    取預(yù)處理樹脂20 g(體積28 ml),裝柱(直徑2 cm)。取上樣藥液(45.56 mg/ml)200 ml,以1 BV/h流速上樣。收集流出液,每份14 ml。以總黃酮質(zhì)量濃度為考察指標(biāo)繪制泄漏曲線,結(jié)果見圖2。

    由圖2可見,當(dāng)上樣吸附84~98 ml(3.5 BV)時(shí),開始有泄漏,故確定吸附終點(diǎn)為總黃酮:樹脂=4.5:20,上樣藥液:樹脂(v/v)=3.5:1。

    圖2 重新確定吸附終點(diǎn)的泄露曲線

    2.8 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化大孔吸附樹脂柱洗脫工藝

    2.8.1 因素及水平考察 根據(jù)單因素探索性試驗(yàn)結(jié)果,選擇水洗體積數(shù)、洗脫液濃度、洗脫液體積數(shù)、洗脫流度等4個(gè)因素,每個(gè)因素選擇3個(gè)水平,設(shè)定因素水平,見表5。

    表5 洗脫工藝正交試驗(yàn)因素水平

    2.8.2 取金剛藤藥材細(xì)粉,按2.2項(xiàng)下要求制備上樣藥液,按2.6和2.7項(xiàng)下優(yōu)選最佳工藝進(jìn)行吸附,按L9(34)正交表設(shè)計(jì)方案進(jìn)行洗脫,檢測水洗脫液、醇洗脫液含量,計(jì)算醇洗脫液解析率。將醇洗脫液回收乙醇、減壓濃縮、70 ℃減壓干燥,檢測總黃酮含量,測定結(jié)果及方差分析結(jié)果見表6。

    表6 篩選洗脫參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果

    由表6可見,考慮醇洗脫液解析率,最佳工藝為A3B2C2D3;考慮提取物總黃酮含量,最佳工藝為A3B2C2D2。由方差分析可見,水洗體積數(shù)、洗脫液濃度對解析率、總黃酮含量有顯著影響。綜合考慮耗能等因素,最佳工藝定為A2B2C2D2,即水洗體積數(shù)2 BV、洗脫液濃度60 %、洗脫液體積數(shù)6 BV、洗脫流度1 BV/h。

    2.9 干燥溫度考察

    取上樣藥液70 ml,按2.3~2.8項(xiàng)下操作得60 %乙醇洗脫液500 ml,減壓回收乙醇,平均分為3份,轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中,減壓干燥(60,70,80 ℃)。干燥后,研細(xì),稱重,得金剛藤總黃酮提取物。按2.1項(xiàng)下操作測定總黃酮含量,結(jié)果見表7。由表7可見,干燥溫度對總黃酮含量無明顯影響,但60 ℃干燥時(shí)間較長,因此確定減壓干燥溫度為70 ℃。

    表7 不同干燥溫度對總黃酮含量影響結(jié)果

    2.10 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

    為考察上述工藝的穩(wěn)定性,按最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)(n=3),分別測定金剛藤總黃酮提取物中總黃酮含量,結(jié)果見表8。由表8可見,該工藝穩(wěn)定、可行。

    表8 3批工藝驗(yàn)證結(jié)果

    2.11 樹脂再生使用試驗(yàn)

    按照工藝驗(yàn)證試驗(yàn)方法連續(xù)10次試驗(yàn),結(jié)果LS303型樹脂的重復(fù)使用性能較好,重復(fù)使用10次之后,吸附率和解析率無明顯變化。

    3 討論

    3.1 由于工業(yè)化生產(chǎn)均使用全自動設(shè)備,多為動態(tài)吸附,因此本試驗(yàn)采用靜態(tài)吸附篩選樹脂型號后,與動態(tài)吸附進(jìn)行比較研究,發(fā)現(xiàn)動態(tài)吸附的吸附率高于靜態(tài)吸附。

    3.2 本試驗(yàn)篩選吸附終點(diǎn)為上樣藥液:樹脂(v/v)=3.5:1,在此條件下,仍有少量泄露,為降低損失,擴(kuò)大生產(chǎn)時(shí)可適當(dāng)降低比例。

    3.3 金剛藤吸附結(jié)束,樹脂柱內(nèi)仍有部分上樣藥液,含有較多非黃酮類成分,因此本試驗(yàn)考察了水洗脫體積數(shù),水洗2 BV和3 BV無明顯差異,因此選擇水洗2 BV。

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