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    烏藥提取物對(duì)伴刀豆凝集素A致免疫性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究

    2018-10-19 08:10:32潘建強(qiáng)
    浙江中醫(yī)雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:烏藥免疫性提取物

    潘建強(qiáng) 彭 昕

    1 浙江省德清縣人民醫(yī)院 浙江 德清 313200

    2 浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校 浙江 寧波 315100

    免疫性肝損傷是由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)炎癥性病變,其重要特征是血清自身抗體陽(yáng)性,肝組織內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),從而導(dǎo)致肝臟損傷。免疫性肝損傷是肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等肝臟疾病轉(zhuǎn)歸和發(fā)生發(fā)展的誘發(fā)因素。因此,積極治療免疫性肝損傷有著十分重要的意義。烏藥是一味具有行氣止痛、溫腎散寒功效的傳統(tǒng)中藥,近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),烏藥提取物可減輕急性酒精性肝損傷[1-2]。本文利用伴刀豆凝集素A(ConA)所致小鼠免疫性肝損傷模型,探討其對(duì)免疫性肝損傷的潛在功效,為拓展其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑:聯(lián)苯雙酯滴丸購(gòu)自浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠;伴刀豆凝集素A(ConA)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自寧波航景生物科技有限公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天生物科技公司;腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只昆明種雄性SPF級(jí)小鼠,鼠齡7~8周,體重18±3g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。每日12h照明,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。保持飼養(yǎng)室溫、濕度分別為:25±2℃、(55±5)%。

    1.3 藥品制備:烏藥藥材由浙江省天臺(tái)山烏藥生物工程有限公司提供,經(jīng)鑒定為樟科(Lauraceae)山胡椒屬(Lindera)植物烏藥Lindera aggregate(Sims)Kosterm的干燥塊根。將干燥烏藥藥材粉碎,稱取10g,分別用200、100ml的80%乙醇超聲提取2次,每次60min,合并兩次提取液,減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至20ml,使提取液的濃度按生藥計(jì)為0.5g/ml。小鼠灌胃量10、5、1ml/kg則分別制得高、中、低劑量(按生藥計(jì)為5.0、2.5、0.5g/kg)。給藥劑量參考成人臨床常規(guī)用量確定。

    1.4 分組與給藥:60只小鼠按每組10只,隨機(jī)分為6組,Ⅰ組為對(duì)照組(空白),Ⅱ組為肝損傷模型組,Ⅲ組為聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥物對(duì)照組,Ⅳ~Ⅵ組分別為烏藥低、中、高劑量治療組。連續(xù)給藥10天,每日1次,對(duì)照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水,陽(yáng)性藥物組給予聯(lián)苯雙酯溶液(0.10g/kg),低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的提取物,末次給藥后4h造模,除對(duì)照組外,其他各組小鼠尾靜脈注射ConA 25mg/kg誘導(dǎo)ConA免疫性肝損傷模型[3]。

    1.5 檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定:造模8h后小鼠眼靜脈叢取血,全血在4℃、5000r/min,離心5min,取上層血清置4℃貯存?zhèn)溆?,檢測(cè)血清中ALT、AST、TNF-α活性。摘眼球取血后處死小鼠,并迅速分離肝、脾,稱取質(zhì)量,計(jì)算小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。小鼠肝臟指數(shù)=(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%,小鼠脾臟指數(shù)=(脾質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。取相同部位大小約0.3cm×0.3cm×0.3cm的肝組織,經(jīng)10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,HE染色,顯微鏡下比較各組病理組織的形態(tài)學(xué)變化差異;并采用比色法檢測(cè)肝組織勻漿中SOD、MDA的活性和含量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組數(shù)據(jù)以-x±s表示結(jié)果。組間采用One-way ANOVA方差分析,差異顯著水平為P<0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 烏藥提取物對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響:除對(duì)照組外,經(jīng)ConA誘導(dǎo)的其它各組小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的損傷,其中模型組的肝損傷最明顯,整肝呈現(xiàn)顆粒狀,與對(duì)照組相比,肝、脾明顯腫大,肝脾指數(shù)顯著升高(P<0.05),其它各組的肝表面均有大小不同的壞死斑,表明造模成功。烏藥各劑量給藥組均能夠降低肝脾指數(shù),中、高劑量組效果均達(dá)顯著水平(P<0.05)。其中高劑量組抑制肝臟指數(shù)增大的效果與陽(yáng)性藥物聯(lián)苯雙酯組相似,說(shuō)明烏藥提取物能抑制肝臟、脾臟的增大,且呈一定的劑量相關(guān)性。見表1。

    2.2 烏藥提取物對(duì)小鼠急性免疫性肝損傷肝組織病理學(xué)變化的影響:HE染色可見正常組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常,未見明顯病理?yè)p傷,肝索及肝血竇排列規(guī)則,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊,肝索結(jié)構(gòu)消失,會(huì)管區(qū)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞擴(kuò)張并含有大量紅細(xì)胞,脂滴空泡,可見點(diǎn)狀壞死及小灶狀壞死。陽(yáng)性藥物組和各給藥組均能不同程度地減輕肝臟受損程度。高劑量組肝索基本呈放射狀排列,肝竇結(jié)構(gòu)較清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞腫脹及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與模型組相比有明顯改善。見圖1。

    圖1 各組HE染色肝臟病理觀察(×40)

    2.3 烏藥提取物對(duì)肝損傷小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響:見表2。

    表2 烏藥提取物對(duì)肝損傷小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響(-x±s)

    3 討論

    ConA致小鼠肝損傷是常用的免疫性肝損傷模型。ConA主要效應(yīng)細(xì)胞有輔助性T細(xì)胞(Th)和巨噬細(xì)胞,進(jìn)入體內(nèi)后可激活肝竇內(nèi)的大量巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子直接損傷肝細(xì)胞,大量活化的T淋巴細(xì)胞可隨血流到達(dá)肝臟,或激活巨噬細(xì)胞使血管內(nèi)皮細(xì)胞被破壞,最終導(dǎo)致免疫性肝損傷[4]。MDA是自由基損傷機(jī)體不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,其含量高低往往與機(jī)體和細(xì)胞的受損程度成正比。SOD是機(jī)體抗氧化體系中起重要作用的一種含金屬離子酶,可通過催化超氧自由基的歧化反應(yīng)清除活性氧自由基,保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性。由肝巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,并誘導(dǎo)多個(gè)調(diào)節(jié)免疫和炎癥過程的基因轉(zhuǎn)錄,是參與免疫性肝損傷的重要因素之一。ALT和AST是分布在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性酶,肝臟受損后便釋放入血,因此血清ALT和AST水平高低常作為判定肝損傷程度的重要指標(biāo)。

    本研究結(jié)果表明,烏藥各劑量給藥組均能夠降低肝、脾指數(shù),中、高劑量組可使血清ALT、AST水平顯著降低,且變化趨勢(shì)與給藥濃度成正比。各劑量組的MDA和

    TNF-α水平都顯著下降,高劑量組還可顯著提高SOD活性(P<0.05),說(shuō)明其可以通過提高肝細(xì)胞中抗氧化酶活性,抑制肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化等來(lái)降低免疫性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激程度,從而改善肝損傷情況。由此可見,烏藥對(duì)ConA所致的免疫性肝損傷有較好的拮抗作用,為烏藥保肝藥效的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    4 參考文獻(xiàn)

    [1]季夢(mèng)漂,譚明明,王軍偉,等.烏藥不同提取物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腸推進(jìn)率的影響[J].浙江中醫(yī)雜志,2017,52(9):700-701.

    [2]陳卓亮,王軍偉,譚明明,等.烏藥水提物與醇提物對(duì)急性酒精性肝損傷模型大鼠抗氧化作用的比較研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2015,50(6):414-415.

    [3]鄭丹丹,姜楠,胡揚(yáng)揚(yáng),等.雙孢菇胞內(nèi)和胞外多糖對(duì)伴刀豆凝集素A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2017,31(4):303-310.

    [4]馬靜,姚廣濤.保肝藥效篩選方法及中藥保肝的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2016,22(23):4671-4675.

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