胸水細(xì)胞蠟塊在肺癌診斷和EGFR基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究*

陳一峰，陳婷，陳瑋姍，姚錫虎，張坤河，李輝，蘇春陽

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院 病理科，福建 泉州 362000）

一項(xiàng)權(quán)威大規(guī)模統(tǒng)計(jì)表明，肺癌在中國的發(fā)病率和死亡率最高，老年人（＞60歲）是高發(fā)人群[1]。＞50%肺癌患者出現(xiàn)胸腔積液，約15%肺癌患者被確診時(shí)已有胸腔積液[2]，轉(zhuǎn)移性肺腺癌是引起晚期肺癌伴胸腔積液最常見的病因，伴有惡性胸水的肺癌患者已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinaseinhibitors,EGFR-TKIs）靶向用藥為其首選治療方案。本科室常規(guī)開展細(xì)胞學(xué)涂片、細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色檢查明確肺腺癌的診斷，而后檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞蠟塊標(biāo)本的表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor,EGFR）基因的突變情況，并與同期活檢或手術(shù)的肺腺癌組織塊的EGFR基因突變情況進(jìn)行對(duì)比，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2016年1月-2017年6月福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院病理科歸檔保存的胸水常規(guī)涂片和細(xì)胞蠟塊切片292例，胸水均為臨床經(jīng)胸腔穿刺現(xiàn)抽即送（非胸腔引流裝置留存）的標(biāo)本，細(xì)胞蠟塊切片均有對(duì)應(yīng)的相關(guān)免疫組織化學(xué)染色。其中，男性190例，女性102例；年齡39～84歲，中位數(shù)年齡65歲。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞蠟塊制備 取胸水100～150 ml置于2、3管50 ml錐形試管內(nèi)，2 000 r/min離心10 min，棄上清液。常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片后，加入10%中性甲醛，2 000 r/min離心5 min，固定＞3 h。待試管底部沉渣質(zhì)地變硬，用一次性竹簽小心刮取沉淀物于包埋紙，與組織塊一起固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining, HE）染色。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 用自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀染色（瑞士，Roche Benchmark XT），DAB顯色，中性樹膠封片，光鏡下觀察切片。所有抗體購自福建邁新生物技術(shù)有限公司，常規(guī)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。根據(jù)細(xì)胞學(xué)涂片和細(xì)胞蠟塊切片，針對(duì)性地選擇一抗，參考臨床病史縮小抗體范圍。常規(guī)選擇TTF-1、NapsinA抗體；懷疑消化系統(tǒng)源性轉(zhuǎn)移性腺癌，加選CDX2、CK20、CK7、Villin；懷疑乳腺源性，加選ER、PR、GATA3、GCDFP15；懷疑卵巢、輸卵管、子宮源性，加選pax8、Vim、WT1、CA125；選擇CR、MC、D2-40、BerEP4、Desmin標(biāo)記區(qū)分腺癌或增生間皮細(xì)胞；懷疑小細(xì)胞癌，加選CgA、Syn、CD56。TTF-1、CDX-2、ER、PR、GATA3、pax8、WT1均為細(xì)胞核著色；NapsinA、Villin、GCDFP15、Vim、CA125、MC、D2-40、Desmin、ALK、CgA、Syn 均為細(xì)胞質(zhì)著色；BerEP4、CD56為細(xì)胞膜著色；CR為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著色；CK7、CK20為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)著色。

1.2.3EGFR基因突變檢測(cè) DNA石蠟組織切片提取試劑盒（離心柱型）及EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）購自北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司。細(xì)胞蠟塊切片組織DNA的提取和樣品經(jīng)驗(yàn)證符合要求后，采用擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）， 應(yīng) 用 Stratagene Mx3000P qRTPCR 儀檢測(cè)EGFR外顯子 18、19、20、21（Exon18-21）29種常見形式的突變，19Del、L858R通過ARMS法擴(kuò)增。見圖1、2。

圖1 EGFR基因19Del點(diǎn)突變擴(kuò)增圖

圖2 EGFR基因Exon21 L858R點(diǎn)突變擴(kuò)增圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)涂片與細(xì)胞蠟塊切片結(jié)合免疫組織化學(xué)染色的病理診斷比較

292例患者胸水行常規(guī)涂片檢查，查見癌細(xì)胞，即陽性139例；未查見癌細(xì)胞，即陰性86例；查見異型或疑癌細(xì)胞，即不確定67例。292例患者胸水細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，陽性175例，陰性114例，不確定3例。兩種方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=75.861，P=0.000），后者陽性檢出率高于前者，且不確定構(gòu)成比低于前者。

175例細(xì)胞蠟塊查見癌細(xì)胞，呈單個(gè)、簇狀、腺管狀排列（見圖3），可見炎癥及纖維素性背景（見圖4），其中TTF-1、NapsinA陽性，支持肺腺癌者166例；呈實(shí)性巢狀排列，相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌酶標(biāo)陽性（見圖5），支持小細(xì)胞癌者3例；其中ER、PR、GATA3（見圖6）、GCDFP15陽性，支持乳腺癌者5例；其中pax8、Vim、WT1、CA125陽性，支持卵巢癌者1例。3例因可供診斷的細(xì)胞過少，而歸入不確定者。

圖3 癌細(xì)胞呈單個(gè)、簇狀、腺管狀排列 （×200）

圖4 炎癥及纖維素性背景中的癌細(xì)胞 （×200）

圖5 癌細(xì)胞CD56陽性 （×200）

圖6 癌細(xì)胞GATA3陽性 （×200）

2.2 細(xì)胞蠟塊與組織塊的EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果比較

EGFR無任何突變定義為野生型，即EGFR陰性；有任意突變類型的定義為突變型，即EGFR陽性。175例細(xì)胞蠟塊中，EGFR陽性84例，陽性率為48%，其中女性54例，男性30例。同期檢測(cè)305例活檢或手術(shù)切除標(biāo)本組織塊的EGFR基因突變情況，EGFR陽性131例，陽性率為42.95%，其中女性80例，男性51例。用細(xì)胞蠟塊與組織塊檢測(cè)EGFR基因突變的陽性率及男女構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.146和 0.226，P=0.284和 0.635）。

3 討論

胸水標(biāo)本在病理科甚是常見，肺癌是引發(fā)胸水的主要病因之一，為明確診斷和后續(xù)精準(zhǔn)治療的需要，收集和保存好胸水中有限的細(xì)胞尤為重要。本科將臨床送檢“新鮮”的胸水沉渣石蠟包埋，制成細(xì)胞蠟塊，結(jié)果顯示細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)染色的陽性檢出率高于細(xì)胞涂片，且不確定構(gòu)成比低于細(xì)胞涂片，說明單憑傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)涂片檢查診斷腫瘤存在缺陷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)67例細(xì)胞學(xué)涂片診斷不確定者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，普遍的現(xiàn)象是可供診斷的瘤細(xì)胞數(shù)量比較少，加上分化好的癌細(xì)胞與增生間皮難以分辨，造成診斷者的憂慮，而出現(xiàn)異型、疑癌細(xì)胞的報(bào)告內(nèi)容。細(xì)胞蠟塊HE切片中細(xì)胞的分布保留與實(shí)體組織類似的排列結(jié)構(gòu)，可提高診斷的準(zhǔn)確性。而且細(xì)胞蠟塊的連續(xù)切片可應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色，為腫瘤分型提供客觀依據(jù)，有利于提示臨床確定相關(guān)部位的原發(fā)灶，正如本實(shí)驗(yàn)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)與免疫組織化學(xué)結(jié)果，再根據(jù)臨床病史、陽性體征，先后診斷了小細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、卵巢癌。國外學(xué)者UGURLUOGLU[3]和MIYOSHI[4]等也強(qiáng)調(diào)細(xì)胞蠟塊的診斷價(jià)值。并且有研究指出，細(xì)胞蠟塊是晚期非小細(xì)胞肺癌ALK檢測(cè)的良好替代物[5]。

EGFR是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡的跨膜蛋白，在非小細(xì)胞肺癌患者中檢測(cè)EGFR基因的突變狀態(tài)具有重要的臨床意義，是決定患者是否能夠應(yīng)用EGFR-TKIs治療的先決條件[6]。ARMS法利用特異性引物選擇性的擴(kuò)增突變基因，而熒光探針在Taq酶的作用下水解釋放熒光，在qRT-PCR儀平臺(tái)上進(jìn)行DNA樣本的基因突變檢測(cè)，ARMS法比直接測(cè)序法更加敏感，可檢測(cè)樣本中低至1%的突變，更適用于腫瘤含量較少的標(biāo)本檢測(cè)[7]。本實(shí)驗(yàn)采用ARMS法分別檢測(cè)胸水細(xì)胞蠟塊和同期活檢或手術(shù)標(biāo)本組織塊的EGFR基因突變情況，發(fā)現(xiàn)用細(xì)胞蠟塊與組織塊檢測(cè)EGFR基因突變的陽性率及男女構(gòu)成比無差異，2種樣本的檢測(cè)效果相當(dāng)，本研究中19和21號(hào)外顯子的突變檢出率達(dá)95%左右，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8-9]。

按照細(xì)胞學(xué)涂片診斷癌→結(jié)合細(xì)胞蠟塊形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)果診斷為肺腺癌→ARMS-qPCR法檢測(cè)EGFR基因突變的流程處理肺癌胸水標(biāo)本，確實(shí)行之有效、值得推廣。細(xì)胞蠟塊一方面有助于明確診斷腫瘤的類型、來源，另一方面可成為DNA提取的樣品來源，國內(nèi)已有用HRM方法檢測(cè)胸水腺癌細(xì)胞蠟塊EGFR基因突變的可行性研究[10]。伴有癌性胸水的晚期肺癌患者，腫瘤實(shí)體活檢組織往往難以獲取，此時(shí)細(xì)胞蠟塊可用于相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)，有利于臨床篩選靶向用藥適用患者及判斷耐藥機(jī)制，從而更好地為患者制定個(gè)體化治療方案。