辣椒花藥培養(yǎng)消毒技術(shù)分析

梁寶萍，趙紅星，王 勇，李 艷，姜 俊

（駐馬店市蔬菜遺傳育種工程技術(shù)研究中心·駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院 河南駐馬店 463000）

花藥培養(yǎng)技術(shù)是把發(fā)育到一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上，改變花粉粒的發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織。隨后由胚狀體直接發(fā)育為植株或誘導愈傷組織分化成植株。辣椒花藥培養(yǎng)是近年來獲得辣椒單倍體的主要途徑[1]，關于辣椒的花藥培養(yǎng)，早在1973年就獲得單倍體植株的報道[2-3]，之后大多數(shù)學者對培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法研究較多[4-7]，并取得了一定的進展。

但是，辣椒花藥中普遍存在的問題仍未解決，污染、褐化、玻璃化是阻礙花藥培養(yǎng)的三大殺手，相比較而言污染極易發(fā)生，污染率達到50%甚至100%，造成大量人力、物力、財力的浪費，是制約辣椒花藥培養(yǎng)成功與否的關鍵因素之一，因此，控制污染成了組培中的首要技術(shù)[8]。培養(yǎng)材料的滅菌是植物組培工作中的重要環(huán)節(jié)，它既要求將外植體表面的微生物徹底殺死，要求盡可能減少傷害外植體組織和表面細胞[9]。使用時應注意消毒劑的消毒時間。辣椒花藥培養(yǎng)中污染控制的研究報道較罕見。高玉蓉等[10]在辣椒污染控制中采用0.01%的HgCl2溶液，消毒液中不必添加吐溫的方法減少花藥污染率。朱迎春等[11]在對西瓜花藥培養(yǎng)時用0.1%HgCl2消毒8 min把污染率降到3.89%，褐化率1.11%，效果最優(yōu)。張芬蘭等[12]在甜椒花藥培養(yǎng)抑菌試驗分析中用5%NaClO消毒10 min，取得了較好的效果。

筆者通過對文獻進行分析和研究實踐，對消毒劑和消毒時間進行研究，進而選擇針對實驗室環(huán)境條件的最佳消毒劑和消毒時間，為辣椒花藥培養(yǎng)打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料‘駐椒18-5-1-7’，是駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院自主選育的辣椒自交系材料，于2017年3月15日定植于駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院試驗田溫室大棚，該材料具有出胚能力，污染率達90%。由駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所提供，無菌操作在駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 取材方法 在盛花期，于晴天日溫較低、日照較弱的下午，取無病蟲危害、花萼與花瓣近等長的花蕾（此時花粉多為小孢子單核期中后期），取后放入采樣盒中帶回放入4℃冰箱保存。

1.2.2 滅菌處理 試驗材料用具準備、接種過程都進行嚴格規(guī)范操作，最大限度減少人為因素的污染。采集材料處于單核期的花蕾放入無菌的小燒杯中，用75%酒精浸泡30 s，然后依次用5%NaClO、0.1%HgCl2溶液和分別加入吐溫20的5%NaClO和0.1%HgCl2溶液滅菌，不斷的攪拌消毒液，消毒6、8、10 min共12個處理進行滅菌，如表1。滅菌后取出花藥接種于6 mm倒有培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)皿中。每個處理接種20皿，每皿接種18枚花藥，重復3次。接種完畢后，在33℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d，25℃暗培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計污染率、褐化率、存活率。公式如下：

表1 花藥消毒滅菌處理

污染率/%=（污染的花藥數(shù)量/接種的花藥數(shù)量）×100；

褐化率/%=（褐化的花藥數(shù)量/接種的花藥數(shù)量）×100；

存活率/%=（存活的花藥數(shù)量/接種的花藥數(shù)量）×100。

1.2.3 試驗儀器 超凈工作臺（蘇凈安泰SW-CJ-2FD），高壓滅菌鍋（志威GR85DA），光照培養(yǎng)箱（上海左樂PGX-80C）。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用Excel 2007軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒液消毒效果比較

由圖1看出，消毒液不同程度地控制了污染，不同消毒液不同處理時間處理的花藥污染率差異均達顯著水平。污染率最高的是5%NaClO加0.2%吐溫20消毒6 min，平均污染率達66.3%。0.1%HgCl2消毒液消毒10 min平均污染率最低為20.3%，其次為0.1%HgCl2消毒液消毒8 min平均污染率為26.0%。

圖1 不同消毒劑不同時間花藥平均污染率

2.2 不同消毒液對花藥培養(yǎng)的影響

2.2.1 0.1%HgCl2與5%NaClO消毒效果比較 從表2看出，2種不同的消毒液都表現(xiàn)出處理時間越長污染率越低，而褐化率有不同程度的增加。在消毒時間相同時，0.1%HgCl2的消毒花藥的污染率明顯低于5%NaClO，但褐化率普遍高于5%NaClO。綜合來看，0.1%HgCl2溶液消過毒的花藥存活率明顯高于5%NaClO消毒的花藥，0.1%HgCl2溶液的消毒效果好于5%NaClO的消毒液。

2.2.2 加吐溫20與不加吐溫20消毒液比較 表2顯示，用加入0.2%吐溫20的5%NaClO消毒，隨消毒時間的增加，污染率比不加吐溫20低，同時存活率也高。而用0.1%HgCl2溶液消毒，污染率、褐化率、存活率均大于加入吐溫20的消毒液。用加入吐溫20的0.1%HgCl2溶液消過毒的花藥比加入吐溫20的5%NaClO的污染率低，存活率高，但褐化率高。

2.2.3 加入吐溫的消毒液效果比較 在表2中，兩種消毒劑中分別加入0.2%吐溫20時，5%NaClO溶液消毒花蕾時隨消毒時間的增加污染率減少，存活率升高。用0.1%HgCl2的溶液消毒時，污染率表現(xiàn)出8 min＞10 min＞6 min，沒有表現(xiàn)出5%NaClO溶液消毒效果的規(guī)律。加入吐溫20的5%NaClO在消毒6 min、8 min時花藥存活率低于0.1%HgCl2，加入吐溫20的5%NaClO的消毒效果在消毒10 min時存活率高于加入吐溫的0.1%HgCl2。

表2 不同消毒液對辣椒花藥的影響

3 討論與結(jié)論

本次試驗研究發(fā)現(xiàn)，0.1%HgCl2消毒10 min消毒效果最優(yōu)，花藥存活率最高，消毒液不用加吐溫，這與張?zhí)煜璧萚13]和高玉蓉等[10]的結(jié)果相同。原玉香等[14]的試驗中用0.1%HgCl2消毒6 min，劉廣霞等[15]的試驗中0.1%HgCl2消毒8 min，張菊平[1]5%NaClO消毒10 min；王忠慧等[16]的試驗中5%NaClO消毒8 min，花藥存活率較高。這可能和材料、種植地點、接種條件、材料類型有關。

另外，研究表明HgCl2的穿透能力比NaClO強，0.2%吐溫20起到表面活性劑的作用，加入吐溫20的5%NaClO和0.1%HgCl2隨著消毒時間的不同表現(xiàn)各異。在加入吐溫20的5%NaClO消毒液中，隨著時間的增長，材料存活率比不加吐溫20的存活率高，產(chǎn)生這種情況的可能原因是：吐溫是表面活性劑，主要作用使消毒液更容易展布，更容易浸入到滅菌材料表面。加入吐溫后，隨著時間的增加，HgCl2對材料的傷害也在增加，褐化率均大于NaClO。為了降低褐化率，可以適當延長NaClO+吐溫20的消毒時間，仍需進一步研究。但在0.1%HgCl2消毒液中加入吐溫20時，污染率、褐化率均大于不加吐溫20的消毒液，和吐溫在NaClO中的規(guī)律相反，原因有待研究。

該試驗選取的幾種消毒液處理主要通過翻閱相關文獻和實踐經(jīng)驗操作篩選擇出，并對2種消毒液中加吐溫20進行了擴展，結(jié)果具備一定的代表性。不同植物對應的消毒劑、消毒時間都有所差異，辣椒適宜的消毒劑是0.1%HgCl2消毒10 min，外生菌污染率降低，但是內(nèi)生菌在培養(yǎng)一段時間之后有所顯現(xiàn)，還需選擇適當?shù)目股剡M行抑菌。