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    三種檢測(cè)豬瘟疫苗中牛血清蛋白含量的ELISA試劑盒的性能對(duì)比

    2018-10-17 07:32:34曹玉美方茜陸江孫如水孫龍
    四川畜牧獸醫(yī) 2018年10期
    關(guān)鍵詞:豬瘟試劑盒疫苗

    曹玉美,方茜,陸江,孫如水,孫龍

    (廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng),廣西 橫縣 530317)

    當(dāng)前疫苗生產(chǎn)中普遍采用牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)的主要成分,這導(dǎo)致疫苗中不同程度地殘留有牛血清蛋白,牛血清殘余蛋白對(duì)于機(jī)體來(lái)說(shuō)是一種異源蛋白,如果殘留種類多,注射疫苗后就可能引起過(guò)敏性休克等不良反應(yīng)[1]。目前已見(jiàn)報(bào)道的過(guò)敏成分主要是牛血清白蛋白(BSA)和牛血清IgG(B-IgG)。為了有效控制過(guò)敏原含量,《中國(guó)生物制品規(guī)程(2000年版)》明確規(guī)定疫苗中牛血清蛋白的殘余量不得超過(guò)50ng/mL[2]。由于疫苗質(zhì)量的安全性越來(lái)越受到關(guān)注,因此,建立檢測(cè)疫苗中牛血清蛋白殘留量的方法和研制相關(guān)試劑盒具有十分重要的意義。早在2004年國(guó)內(nèi)已經(jīng)研制出能定量檢測(cè)牛血清蛋白含量的酶聯(lián)免疫試劑盒,市面上也出現(xiàn)了許多廠家研制的檢測(cè)牛血清蛋白含量的ELISA試劑盒,而眾多試劑盒的檢測(cè)效果存在差異,選擇一款穩(wěn)定性好、靈敏度高的試劑盒成為有效控制牛血清蛋白含量的關(guān)鍵。本試驗(yàn)從市面上選購(gòu)了3種用于檢測(cè)豬瘟疫苗中牛血清蛋白含量的ELISA試劑盒(分別為A、B、C),由本實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)這3種試劑盒進(jìn)行各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)驗(yàn)證,并分別用其對(duì)18個(gè)豬瘟疫苗樣品進(jìn)行牛血清蛋白含量檢測(cè),以此評(píng)價(jià)這3種試劑盒用于常規(guī)疫苗質(zhì)量控制的可行性。

    1 材料

    1.1 檢測(cè)儀器及試劑 酶標(biāo)儀;ELISA試劑盒A(生產(chǎn)批號(hào):201708),其檢測(cè)范圍為 1~45ng/mL;ELISA試劑盒B(生產(chǎn)批號(hào):2017082809),其檢測(cè)范圍為1~45 ng/mL;ELISA 試劑盒 C(生產(chǎn)批號(hào):201708),其檢測(cè)范圍為0.5~80ng/mL。所有試劑盒均在保質(zhì)期內(nèi)使用。

    1.2 待檢樣品 選擇18個(gè)豬瘟疫苗作為待檢樣品。

    2 方法

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確按照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,通過(guò)對(duì)比3種試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程的相關(guān)性及變異系數(shù)來(lái)驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定性。具體操作步驟如下:

    2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 準(zhǔn)備5支稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管,每支EP管加入150μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行倍比稀釋,得到5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,試劑盒A的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為2.5、5、10、20、40ng/mL,試劑盒B的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為2.5、5、10、20、40ng/mL,試劑盒 C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為5、10、20、40、80ng/mL。

    2.1.2 加樣 將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)均勻,并設(shè)置空白孔(不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步驟操作相同)。

    2.1.3 溫育 用封口膜封板后置37℃恒溫箱中溫育30min。

    2.1.4 配液 將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后使用。

    2.1.5 洗滌 小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30s后棄去。如此重復(fù)5次,拍干。

    2.1.6 加酶 每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL,空白孔除外。

    2.1.7 溫育、洗滌 操作同上。

    2.1.8 顯色 每孔加入顯色劑A 50μL,再加入顯色劑B 50μL,輕輕振蕩混勻,37℃避光顯色10min。

    2.1.9 終止 每孔加入終止液50μL,終止反應(yīng)。

    2.1.10 測(cè)定 以空白孔調(diào)零,450nm波長(zhǎng)讀取各孔吸光度值。

    2.2 豬瘟疫苗樣品檢測(cè) 準(zhǔn)確按照試劑盒的操作說(shuō)明對(duì)本場(chǎng)的18個(gè)豬瘟疫苗樣品進(jìn)行牛血清蛋白含量測(cè)定,每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù),取平均值。具體操作同2.1步驟,只是在加樣時(shí)先加入40 μL樣品稀釋液,再加入10 μL待測(cè)樣品,最終將樣品稀釋5倍,其余步驟均相同。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線性方程和樣品吸光度,測(cè)得樣品中牛血清蛋白的含量,并對(duì)其變異系數(shù)進(jìn)行對(duì)比,比較檢測(cè)結(jié)果的差異及符合程度。

    3 結(jié)果

    3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 3種試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)詳見(jiàn)表1。試劑盒A的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.079 1x+0.4997,相關(guān)系數(shù)為0.9692;試劑盒B的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0350x-0.0089,相關(guān)系數(shù)為0.9948;試劑盒C的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0045x+0.0787,相關(guān)系數(shù)為0.9884??梢?jiàn)試劑盒B的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性較高。

    表1 3種試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)

    3種試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的變異系數(shù)詳見(jiàn)圖1。由圖可知,試劑盒A的變異系數(shù)在0.005~0.115之間,試劑盒B的變異系數(shù)在0.005~0.439之間,試劑盒C的變異系數(shù)在0.104~0.260之間。可見(jiàn)試劑盒A標(biāo)準(zhǔn)曲線的變異系數(shù)最小。

    圖1 3種試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的變異系數(shù)

    3.2 豬瘟疫苗樣品中牛血清蛋白含量的測(cè)定 3種試劑盒對(duì)18個(gè)豬瘟疫苗樣品檢測(cè)所得到的結(jié)果詳見(jiàn)表2。使用試劑盒A檢測(cè)時(shí),樣品濃度均為負(fù)值,說(shuō)明樣品中未檢出牛血清蛋白。使用試劑盒B對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中牛血清蛋白的含量在36.99~57.27ng/mL之間,而試劑盒B的檢測(cè)范圍為1~45ng/mL,其中有10個(gè)樣品濃度超出了檢測(cè)范圍,并且有7個(gè)樣品的牛血清蛋白含量超標(biāo)(>50ng/mL)。由于含量超過(guò)試劑盒檢測(cè)范圍,試劑盒B的檢測(cè)結(jié)果有待考證,需要對(duì)樣品稀釋后進(jìn)行再次檢查。使用試劑盒C檢測(cè)樣品時(shí),發(fā)現(xiàn)樣品中牛血清蛋白的含量在28.07~39.96ng/mL之間,其含量均在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi),且低于生物制品規(guī)程中的相關(guān)規(guī)定。

    表2 3種試劑盒檢測(cè)疫苗樣品中的牛血清蛋白含量 ng/mL

    圖2 3種試劑盒檢測(cè)樣品時(shí)的變異系數(shù)

    3種試劑盒在檢測(cè)18個(gè)豬瘟疫苗樣品時(shí)吸光度值的變異系數(shù)詳見(jiàn)圖2。由圖可知,試劑盒A的變異系數(shù)在0.002~0.186之間,試劑盒B的變異系數(shù)在0.003~0.124之間,試劑盒 C的變異系數(shù)均小于0.063。可見(jiàn)用3種試劑盒檢測(cè)樣品時(shí),試劑盒C的變異系數(shù)最小。

    4 討論

    酶聯(lián)免疫吸附法是一種與國(guó)際接軌的檢測(cè)方法,主要通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定相關(guān)系數(shù),再通過(guò)直線范圍內(nèi)的吸光度值來(lái)計(jì)算出樣品中的牛血清蛋白含量,可以對(duì)樣品進(jìn)行定量測(cè)定,并且具有特異性好、靈敏度佳的優(yōu)點(diǎn)[3]。早在2004年,國(guó)內(nèi)就已經(jīng)研制出了用于檢測(cè)牛血清蛋白的ELISA試劑盒,經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,具有較好的準(zhǔn)確度、靈敏度和可重復(fù)性,且操作快捷。本試驗(yàn)對(duì)3個(gè)不同生產(chǎn)廠家的ELISA試劑盒進(jìn)行了各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)驗(yàn)證,對(duì)比其用于常規(guī)疫苗質(zhì)量控制的可行性。

    通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以看到3種試劑盒的相關(guān)系數(shù)均在0.95以上,相關(guān)系數(shù)最好的是試劑盒B,其次為試劑盒C,試劑盒A最差。但從標(biāo)準(zhǔn)曲線的變異系數(shù)來(lái)看,試劑盒A與試劑盒C的變異系數(shù)趨勢(shì)較一致,波動(dòng)較小,特別是試劑盒A的變異系數(shù)均在0.115以內(nèi);而試劑盒B的變異系數(shù)波動(dòng)較大(有兩個(gè)點(diǎn)的變異系數(shù)高于0.35),說(shuō)明其標(biāo)準(zhǔn)曲線離散度大于其他兩種試劑盒。

    在使用3種試劑盒檢測(cè)疫苗樣品中的牛血清蛋白含量時(shí),試劑盒A的結(jié)果均為負(fù)值,說(shuō)明未檢出,而試劑盒B與試劑盒C的結(jié)果均顯示樣品中含有不同濃度的牛血清蛋白,且試劑盒B的檢測(cè)結(jié)果顯示有7份樣品的牛血清蛋白含量高于50ng/mL,超標(biāo)率為38.88%,而試劑盒C的結(jié)果顯示18個(gè)樣品的牛血清蛋白含量均在規(guī)定范圍內(nèi)。從檢測(cè)樣品的變異系數(shù)來(lái)看,試劑盒A的變異系數(shù)較大,波動(dòng)幅度大于其他兩種試劑盒,而試劑盒B與試劑盒C有較一致的變異趨勢(shì),且試劑盒C的變異系數(shù)最小。說(shuō)明在檢測(cè)樣品時(shí),試劑盒C的重復(fù)性優(yōu)于其他兩種試劑盒。

    5 結(jié)論

    整體而言,試劑盒C表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和可操作性,具有較好的相關(guān)性及可重復(fù)性。由于3種試劑盒所測(cè)樣品的牛血清蛋白含量的差異較大,無(wú)法最終判斷疫苗樣品中牛血清蛋白的含量,故建議使用已知濃度的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行再次檢測(cè),以確定試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性;也可以在檢測(cè)時(shí),適當(dāng)將疫苗樣品稀釋,然后進(jìn)一步檢測(cè)。綜上所述,3種試劑盒的優(yōu)劣各有千秋,還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

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