EGCG體外抗氧化性能及其對(duì)酪蛋白乳化性能的影響

董新玲

(陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710000)

0 引言

食品在加工和儲(chǔ)藏過程中的脂肪氧化是導(dǎo)致其品質(zhì)下降的重要原因，合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)和叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等，長期以來被用于食品中以抑制脂肪氧化.然而已有研究表明人工合成抗氧化劑的長期攝入對(duì)人體健康具有潛在危害，因而天然抗氧化劑越來越受到消費(fèi)者的歡迎和食品領(lǐng)域科學(xué)家的關(guān)注[1].

茶多酚是目前應(yīng)用最廣泛的天然抗氧化劑之一，其在植物油脂中的抗氧化效果是BHT的1.5倍左右，是BHA的2～3倍，是VE的3～4倍[2].茶多酚的主要活性成分是兒茶素類化合物，主要包括：表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，其中 EGCG含量最高(約占到兒茶素總含量的50%)[3]，是茶多酚中最有效的抗氧化活性多酚，其抗氧化活性最少是維生素C的100倍，是維生素E的25倍[4].

酪蛋白約占牛奶中總蛋白的80%左右，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值(含有人體必需的8種氨基酸)和多種功能性質(zhì)(乳化性和凝膠性等)而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[5].例如，作為大分子乳化劑，酪蛋白及其鈉鹽經(jīng)常被用于乳化香腸的生產(chǎn)中.眾所周知，富含酚類的植物提取物，如茶多酚，作為天然抗氧化劑已被廣泛應(yīng)用于肉制品生產(chǎn)加工以抑制脂肪氧化[1].已有研究表明，植物多酚與蛋白相互作用可以改變蛋白質(zhì)的功能特性(發(fā)泡性、乳化性、凝膠性等)[6-8].因而，茶多酚的添加是否會(huì)影響酪蛋白的乳化能力值得關(guān)注.

因此，本課題首先采用六種方法探究EGCG的體外抗氧化性能，其次采用經(jīng)典方法研究EGCG添加對(duì)酪蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響，以期為合理使用EGCG及酪蛋白提供理論依據(jù)和參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料與試劑：大豆油，益海嘉里食品工業(yè)有限公司；EGCG(>98%)，上海純優(yōu)生物科技有限公司；酪蛋白、菲啰嗪、鄰苯二酚紫，上海瑞永生物科技有限公司；吡啶、硫酸亞鐵、硫酸銅、DPPH、水楊酸、過氧化氫、ABTS、過硫酸鉀、乙酸鹽、三氯化鐵、TPTZ、脫氧核糖、EDTA、抗壞血酸、TBA、TCA等，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

(2)主要儀器設(shè)備：JM-B20001型電子天平，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；BP211D電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；UV-1240紫外可見分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司；JBZ-14H型磁力攪拌器，上海大浦儀器有限公司；FJ200-S型高速分散均質(zhì)機(jī)，陜西環(huán)宇儀器設(shè)備有限公司；MIX-25P型迷你混合儀，杭州米歐儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EGCG抗氧化活性的測定

(1)總抗氧化能力的測定[9]—亞鐵離子還原能力(FRAP)

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用移液槍分別準(zhǔn)確吸取不同濃度的硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmol/L)各0.10 mL，加入0.30 mL去離子水和3 mL FRAP工作液，搖勻后在37 ℃水浴4 min，于593 nm處測定其吸光度，每個(gè)樣品平行測定三次，根據(jù)所得吸光度的平均值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

不同濃度EGCG總抗氧化能力的測定：實(shí)驗(yàn)組用0.10 mL不同濃度EGCG溶液(50、100、150、200、300、400、500μg/mL)替代硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白對(duì)照組以0.10 mL去離子水替代硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶，其余操作同上.由實(shí)驗(yàn)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相同吸光值處對(duì)應(yīng)的FeSO4濃度，樣品/空白組還原能力用對(duì)應(yīng)的FeSO4濃度(mmol/L)表示.總抗氧化能力通過以下方程式計(jì)算：

樣品抗氧化能力(mmol/L FeSO4)=

樣品還原能力-空白還原能力

(1)

(2)DPPH自由基清除能力的測定[10]用移液槍準(zhǔn)確吸取50μL不同濃度待測樣品溶液，分別與3 mL 60μmol/L的DPPH溶液混合，充分搖勻之后置于暗室避光反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，于516 nm處測定其吸光值A(chǔ)1，以不加EGCG的試劑做空白測定其吸光度值A(chǔ)0，每個(gè)樣品平行測定三次.

DPPH自由基清除率按照以下公式計(jì)算：

(2)

(3)ABTS自由基清除能力的測定[11]

準(zhǔn)確吸取30μL不同濃度的EGCG溶液，與2.97 mL ABTS工作液混合，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，于734 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，以去離子水做空白測定其吸光度值A(chǔ)0，每個(gè)樣品平行測定三次.ABTS自由基清除率計(jì)算公式同公式(2).

(4)羥自由基(OH)清除能力的測定[10]

于10 mL試管中按順序加入250μL不同濃度的EGCG溶液、100μL 28 mmol/L脫氧核糖溶液(DR)、100μL 1 mmol/L過氧化氫溶液，250μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，100μL 100μmol/L三氯化鐵溶液，100μL 104μmol/L乙二胺四乙酸溶液(EDTA)和100μL 1 mmol/L抗壞血酸溶液，充分混勻后于50 ℃條件下水浴20 min，再分別加入1%硫代巴比妥酸(TBA)溶液和2.8%的三氯乙酸(TCA)溶液各1 mL，再次混勻后，于沸水浴中反應(yīng)20 min，之此后置于冰水浴冷卻以終止反應(yīng)，此后加入3.5 mL正丁醇提取顯色團(tuán)，3 300 g離心10 min后，吸取有機(jī)相于532 nm處測定吸光度值A(chǔ)1.空白對(duì)照組以去離子水代替EGCG樣品溶液，吸光度值表示為A0，樣品空白組以去離子水代替過氧化氫，吸光度值表示為A2.每個(gè)樣品平行測定三次.

清除率通過以下公式計(jì)算：

(3)

(5)金屬離子螯合能力測定

Fe2+螯合能力[12]：分別準(zhǔn)確吸取100μL 2 mmol/L FeCl2溶液、3.7 mL去離子水于10 mL 玻璃試管內(nèi)，加入1 mL待測EGCG樣品溶液混勻.準(zhǔn)確反應(yīng)3 min 后，加入200μL 5 mmol/L 菲咯嗪試劑終止反應(yīng)，混勻，靜置10 min后，于562 nm處測定吸光度值A(chǔ)1.空白對(duì)照組以去離子水代替EGCG樣品溶液，吸光度值表示為A0，樣品空白組以去離子水代替菲啰嗪,吸光度值表示為A2.每個(gè)樣品平行測定三次.

Fe2+螯合能力通過以下公式計(jì)算：

(4)

Cu2+螯合能力[13]：在通風(fēng)櫥下，佩戴一次性橡膠手套，用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL吡啶(10%)試劑于帶螺紋玻璃試管中，加入20μL 鄰苯二酚紫試劑(0.1%)，混勻，再加入1 mL CuSO4溶液(2 mmol/L)充分混勻.然后加入1 mL不同濃度EGCG樣品溶液混勻，于632 nm處測定吸光度值A(chǔ)1.以去離子水對(duì)照，測定其吸光度值A(chǔ)0，每個(gè)樣品平行測定三次.

Cu2+螯合能力通過以下公式計(jì)算：

(5)

1.2.2 EGCG結(jié)合對(duì)酪蛋白乳化性能的影響

氧化EGCG溶液的配置：參考Balange和Benjakul的描述并做適當(dāng)修改[14]，用天平準(zhǔn)確稱取0.025 g EGCG溶于40 mL去離子水中，用6 N NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，放置于磁力攪拌器上攪拌8 h，使得溶液顏色變?yōu)楹诩t色，再用6 N HCl將溶液pH調(diào)回7.0，補(bǔ)加去離子水定容至50 mL，則完全氧化的EGCG中濃度為500μg/mL.通過計(jì)算進(jìn)行不同程度稀釋，得到不同濃度的氧化EGCG溶液.

用移液槍分別吸取不同濃度的未氧化或氧化EGCG溶液和0.2%酪蛋白溶液各9 mL于50 mL離心管中，加入大豆色拉油2 g，然后用高速均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min 高速均質(zhì) 1 min之后立即用移液槍從底部吸取乳狀液10μL，然后與 5 mL 0.1%(m/v)SDS溶液混合，以相同濃度的SDS溶液做為空白對(duì)照，用紫外可見分光光度計(jì)在500 nm波長處測其吸光度A0，10 min后再次測量吸光度值A(chǔ)10，每個(gè)樣品獨(dú)立測定三次.

乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)采用如下公式[15]進(jìn)行計(jì)算：

(6)

(7)

式(6)～(7)中：T為2.303；c為乳化前蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)量濃度/(g/mL)；φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)；A0為均質(zhì)后迅速被稀釋的乳化液的吸光度；A10為乳化液在靜止10 min后的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG的抗氧化活性

2.1.1 總抗氧化活性

以不同濃度FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)反應(yīng)后樣品溶液在593 nm處的吸光度值A(chǔ)593繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1(a)所示.以FeSO4濃度x(mmol/L)與其反應(yīng)后相應(yīng)吸光度值y(A593)進(jìn)行線性回歸，所得方程為：y=0.550 4x+0.03，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 2，表明FeSO4濃度在0～1 mmol/L范圍內(nèi)與A593具有良好的線性關(guān)系.

采用相同的實(shí)驗(yàn)方法，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得不同濃度EGCG的總抗氧化能力，如圖1(b)所示.從圖中可以看出，EGCG的總抗氧化能力具有濃度依賴性：總體來說，隨著EGCG濃度增大，其總抗氧化能力進(jìn)一步增強(qiáng)；當(dāng)EGCG濃度為50μg/mL時(shí)，其總抗氧化能力約為0.38 mmol/L Fe2+，當(dāng)EGCG濃度增大到500μg/mL時(shí)，其總抗氧化能力達(dá)到0.71 mmol/L Fe2+，約為初始濃度(50μg/mL)總抗氧化能力的兩倍.Rice研究發(fā)現(xiàn) EGCG抗氧化效果至少是維生素E的25倍，是維生素C的100多倍[16]；臧鵬等研究發(fā)現(xiàn)EGCG 在壓縮餅干中的抗氧化能力是維生素E的2.8倍[17]；這可能與實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)方法的選擇等有關(guān).

(a)亞鐵離子還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線

(b)EGCG總抗氧化能力隨濃度變化曲線圖1 不同濃度EGCG總抗氧化能力

2.1.2 自由基清除能力

不同濃度EGCG的DPPH/ABTS/OH自由基清除能力如圖2所示.從圖2可知，EGCG對(duì)三種自由基的清除效果均具有濃度依賴性，且清除率隨濃度變化的趨勢一致.整體來說，當(dāng)EGCG濃度在50～200μg/mL范圍時(shí)，其三種自由基清除能力隨濃度增大顯著增強(qiáng)，且對(duì)三種自由基清除能力為DPPH>OH>ABTS；當(dāng)EGCG濃度為200μg/mL時(shí)，其自由基清除率已經(jīng)接近峰值，且對(duì)三種自由基清除率為ABTS(92.1%)>DPPH(87.1%)>OH(82.5%)；此后隨ECGC濃度增大，其自由基清除能力無顯著變化.由此可見，當(dāng)EGCG濃度為200μg/mL時(shí)，對(duì)三種自由基的清除率幾乎達(dá)到最佳.朱松研究發(fā)現(xiàn)：在100～800μg/mL濃度范圍內(nèi)，EGCG對(duì)OH自由基的清除效果與濃度之間呈正相關(guān)；當(dāng)濃度為200μg/mL時(shí)，EGCG對(duì)DPPH自由基的清除率約為88.3%[18].

圖2 不同濃度EGCG對(duì)三種自由基的清除能力

2.1.3 金屬離子螯合能力

(1)Fe2+螯合能力

不同濃度EGCG對(duì)Fe2+的螯合能力如圖3(a)所示.在50～500μg/mL范圍內(nèi)，EGCG對(duì)Fe2+的螯合能力基本保持在15%左右，與EGCG自身濃度關(guān)系不大.與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，Zhong等[19]研究發(fā)現(xiàn)，20μg/mL的EGCG對(duì)亞鐵離子的螯合能力約為8%，說明EGCG對(duì)亞鐵離子的螯合能力較弱.

(2)Cu2+螯合能力

不同濃度EGCG對(duì)Cu2+的鰲合能力如圖3(b)所示.整體來說，隨著EGCG濃度增大，其對(duì)二價(jià)銅離子的螯合能力增強(qiáng)，當(dāng)EGCG濃度在50～100μg/mL之間時(shí)，其對(duì)Cu2+的螯合能力約為16%，當(dāng)EGCG濃度上升到200μg/mL時(shí)，其對(duì)二價(jià)銅離子的螯合能力達(dá)到了29.6%，此后隨EGCG濃度上升，其對(duì)Cu2+鰲合能力較緩增強(qiáng)，當(dāng)EGCG濃度上升到在400～500μg/mL之間時(shí)，其對(duì)Cu2+鰲合能力約為35%左右.由此可見，EGCG的Cu2+的螯合能力明顯高于其Fe2+的螯合能力，且具有較明顯的濃度依賴性.

(a)不同濃度EGCG對(duì)亞鐵離子的鰲合能力

(b)不同濃度EGCG對(duì)銅離子的鰲合能力圖3 不同濃度EGCG對(duì)金屬離子的鰲合能力

2.2 EGCG結(jié)合對(duì)酪蛋白乳化性能的影響

2.2.1 EGCG對(duì)酪蛋白乳化性能的影響

不同濃度EGCG添加對(duì)酪蛋白乳化活性的影響如圖4(a)所示.隨著EGCG添加量的增大，酪蛋白的乳化活性呈下降趨勢.未添加EGCG的酪蛋白(空白樣品)乳化活性最好，約為23%，當(dāng)EGCG添加量為500 mg/mL時(shí)，酪蛋白的乳化活性下降為17%.與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，Cao等人研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)EGCG的添加量在0～200 mg/mL時(shí)，肌原纖維蛋白的乳化活性無顯著變化，當(dāng)EGCG的濃度進(jìn)一步增大時(shí)，肌原纖維蛋白的乳化活性呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是高濃度EGCG的添加導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性降低并引起蛋白聚集，因而在乳化過程中難以伸展并包裹于油滴表面形成蛋白膜界面膜[7].因此高濃度 EGCG 添加導(dǎo)致酪蛋白乳化活性降低可能與其引起的蛋白表面疏水性降低及蛋白聚集有關(guān).

不同濃度EGCG添加對(duì)酪蛋白乳化穩(wěn)定性的影響如圖4(b)所示.未添加EGCG的酪蛋白乳化穩(wěn)定性最差，約為78%.隨著EGCG添加量的增大，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢.EGCG添加量在100～300μg/mL時(shí)，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性上升趨勢較為明顯，而后趨于穩(wěn)定，當(dāng)EGCG濃度上升到500μg/mL時(shí)，其乳化穩(wěn)定性達(dá)到了98%.池海波[20]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚添加會(huì)導(dǎo)致玉米醇溶蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性降低；郭興鳳[21]等研究認(rèn)為茶多酚對(duì)大豆分離蛋白體系乳化性和乳化穩(wěn)定性影響不大，但對(duì)其起泡性和泡沫穩(wěn)定性影響較為顯著.可見，植物多酚對(duì)蛋白功能特性的影響非常復(fù)雜，與多酚的濃度及種類、蛋白的種類、實(shí)驗(yàn)條件等有關(guān).

(a)不同濃度EGCG對(duì)酪蛋白乳化活性的影響

(b)不同濃度EGCG對(duì)酪蛋白乳化穩(wěn)定性的影響圖4 不同濃度EGCG對(duì)酪蛋白乳化性能的影響

2.2.2 氧化EGCG結(jié)合對(duì)酪蛋白乳化性能的影響

EGCG作為抗氧化劑自身易于被氧化，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，配置好的EGCG溶液放置一段時(shí)間后由于氧化作用導(dǎo)致溶液顏色發(fā)生變化.由于氧化后的EGCG與蛋白質(zhì)結(jié)合行為會(huì)發(fā)生變化，因此進(jìn)一步探究了氧化的EGCG添加對(duì)酪蛋白乳化性能的影響.

如圖5(a)所示，氧化EGCG對(duì)酪蛋白乳化活性的影響具有濃度依賴性，當(dāng)濃度在0～200μg/mL范圍時(shí)，氧化EGCG添加幾乎不影響酪蛋白乳化活性，但在400～500μg/mL范圍時(shí)，會(huì)明顯降低乳化活性.

氧化EGCG對(duì)酪蛋白乳化穩(wěn)定性的影響如圖5(b)所示.隨著氧化EGCG添加量的增大，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)上升趨勢.氧化EGCG添加量在0～100μg/mL之間，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性上升趨勢比較明顯，而后上升趨勢較為平緩，當(dāng)EGCG添加量為500μg/mL時(shí)，酪蛋白的乳化活性約為98%.這與未氧化的EGCG對(duì)酪蛋白乳化穩(wěn)定性的影響趨勢基本一致.

(a)氧化EGCG對(duì)酪蛋白乳化活性的影響

3 結(jié)論

采用六種方法測定了EGCG的抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度為50～500μg/mL范圍內(nèi)，EGCG的總抗氧化能力隨濃度增大而迅速增強(qiáng)；EGCG的DPPH、ABTS及羥自由基清除能力趨勢大體一致：在濃度為50～200μg/mL范圍內(nèi)，三種自由基清除能力均隨濃度增大而快速增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到200μg/mL時(shí)，各自由基清除能力基本達(dá)到峰值(DPPH自由基88%，ABTS自由基91%，羥自由基83%)，此后隨濃度增大自由基清除能力無明顯提升；整體來講，EGCG的Fe2+螯合能力基本保持在15%左右，幾乎不受EGCG濃度的影響；Cu2+螯合能力隨濃度增大而增強(qiáng)，當(dāng)濃度為500μg/mL時(shí)，Cu2+螯合能力約為35%，可見EGCG對(duì)Cu2+的螯合能力較Fe2+強(qiáng).因此，EGCG的抗氧化能力主要源于其高效的自由基清除能力，其次是金屬離子螯合能力.因而在富含金屬離子的食品體系中，建議EGCG與高性能的金屬離子螯合劑復(fù)配使用.

乳化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未氧化和氧化EGCG的添加均具有降低酪蛋白的乳化活性、提高了乳化穩(wěn)定性的趨勢，且均表現(xiàn)出了一定的濃度依賴性.當(dāng)EGCG/氧化EGCG濃度在200～300μg/mL時(shí)，酪蛋白兼具較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性.結(jié)合EGCG抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推薦在富含酪蛋白的食品體系中EGCG的添加量在200～300μg/mL.