荷葉中荷葉堿的溶出度考察△

韓婷婷，任曉亮，任德飛，王萌

(天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193)

荷葉為睡蓮科植物荷葉NelumbonuciferaGaerth.的干燥葉，味苦澀，性平，其作為天然有效的保健食品和藥物，越來(lái)越受到人們的青睞。荷葉中含有的荷葉堿是一種阿樸啡型生物堿，藥理研究表明其為荷葉中主要的降脂成分[1]。中藥材的有效成分含量直接影響中成藥和中藥飲片的質(zhì)量。在中藥中，有效成分從藥材中轉(zhuǎn)移至提取液中，除受溶解度的影響，還受溶出度的影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同粒徑荷葉粉體中荷葉堿的體外溶出度進(jìn)行研究，考察在不同粒徑、pH下溶出規(guī)律，并采用Weibull模型進(jìn)行擬合，初步探討粉碎度及pH對(duì)有效成分溶出度的量變關(guān)系。采用相對(duì)較正因子法(f2)對(duì)不同條件下的溶出曲線進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)，以期為中藥開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供方法和思路。

1 材料

1.1 藥品

對(duì)照品荷葉堿(批號(hào)：111566-2000703，含量99.7%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

藥材：荷葉(產(chǎn)地：山東)，為蓮NelumbonuciferaGaerth.的葉(鑒定專家：天津中醫(yī)藥大學(xué)，李天祥教授)。

1.2 試劑

甲醇(美國(guó)sigma公司，色譜純)；乙醇(天津市康科德科技有限公司，分析純)；甲酸(天津化學(xué)試劑批發(fā)公司，分析純)；蒸餾水(屈臣氏集團(tuán)有限公司)。

1.3 儀器

Waters ACQUITY UPLCTM超高效相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；S312-90電動(dòng)攪拌器，山海申生科技有限公司；PB-10 pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；BT125D十萬(wàn)分之一天平，德國(guó)Sartorius公司；2、4、5、6、7號(hào)藥典篩，浙江上虞市五星沖壓篩具廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 粒徑、pH值對(duì)荷葉中荷葉堿體外溶出度的影響

2.1.1 色譜條件及方法學(xué)考察

2.1.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100 mm，1.7 μm)(Waters科技有限公司)

流動(dòng)相：B為甲醇，A為0.1%甲酸-水，進(jìn)樣量：3 μL；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：45 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。荷葉堿的保留時(shí)間為5.64 min。

2.1.1.2 對(duì)照品的配制 稱取荷葉堿對(duì)照品4.03 mg于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容制成0.806 g·L-1的對(duì)照品貯備液。

2.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取對(duì)照品溶液適量，加甲醇配制成0.787 1 μg·mL-1至50.38 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析并記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以最小二乘法求得回歸方程，荷葉堿回歸方程Y=45 441X-4 523.4(r=0.999 9)，結(jié)果表明荷葉堿在0.787 1～50.38 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.1.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取細(xì)粉樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)，RSD為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.1.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取荷葉細(xì)粉10 g，精密稱定，分別置于溶出杯中，漿降入溶出介質(zhì)中，以脫氣純凈水900 mL為溶出介質(zhì)，溫度為(37.0±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，攪拌2 h，吸取溶液2 mL，離心取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，平行6份，RSD為2.6%，重復(fù)性良好。

2.1.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.1.5”項(xiàng)下配制好的溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，RSD% 為2.7%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.1.7 加樣回收率 向配制好的樣品溶液中加入一定量荷葉堿對(duì)照品，測(cè)定其含量，測(cè)得荷葉堿加樣回收率為96.98%，RSD為2.3%，符合方法學(xué)要求。

2.1.2 不同粒徑荷葉粉體制備 取荷葉藥材適量，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過(guò)篩得粗粉、中粉、細(xì)粉、最細(xì)粉：

粗粉(全過(guò)2號(hào)篩，能通過(guò)4號(hào)篩的為20%)；

中粉(全過(guò)4號(hào)篩，能通過(guò)5號(hào)篩的為30%)；

細(xì)粉(全過(guò)5號(hào)篩，能通過(guò)6號(hào)篩的為97%)；

最細(xì)粉(全過(guò)6號(hào)篩，能通過(guò)7號(hào)篩的為97%)。

2.1.3 不同pH緩沖溶液配制 pH 1.2鹽酸溶液：取8.33 mL鹽酸稀釋至1000 mL；

pH 4.5磷酸緩沖溶液：取0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀250 mL，加至1000 mL量瓶中，稀釋至刻度；

pH 6.8磷酸緩沖溶液：取0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀250 mL，加至1000 mL量瓶中，加0.2 mol·L-1氫氧化鈉119 mL，稀釋至刻度，以pH計(jì)對(duì)所制備的溶液進(jìn)行校正。

2.1.4 不同粒徑荷葉中荷葉堿溶出度的測(cè)定[2-5]采用2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(二部)制劑通則0931溶出度測(cè)定方法中第二法進(jìn)行測(cè)定。以脫氣純凈水900 mL為溶出介質(zhì)，溫度(37.0±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，取荷葉粗粉、中粉、細(xì)粉、最細(xì)粉10 g(平行3份)分別置于杯中，漿降入溶出介質(zhì)中立即計(jì)時(shí)，至1、5、10、15、20、40、60、80、100 min時(shí)取樣2 mL，離心取上清經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)濾過(guò)，備用(同時(shí)補(bǔ)充同溫介質(zhì)2 mL及離心沉淀)。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定荷葉堿溶出量，計(jì)算累積溶出百分率，并繪制累積溶出曲線。不同粒徑荷葉中荷葉堿累積溶出曲線見(jiàn)圖1；不同粒徑荷葉中荷葉堿溶出量見(jiàn)表1。

圖1 不同粒徑荷葉粉體中荷葉堿累積溶出量曲線

t/min粗粉/mg·g-1中粉/mg·g-1細(xì)粉/mg·g-1最細(xì)粉/mg·g-110.135 1±0.0090.202 4±0.0090.264 0±0.0130.233 5±0.00550.323 1±0.0170.469 1±0.0200.464 2±0.0030.391 1±0.010100.437 8±0.0120.561 2±0.0230.548 7±0.0030.457 0±0.010150.492 5±0.0120.615 7±0.0240.615 3±0.0120.481 0±0.015200.533 5±0.0100.653 4±0.0160.633 3±0.0140.538 9±0.022400.585 0±0.0100.706 3±0.0210.660 9±0.0100.600 1±0.025600.626 6±0.0160.747 8±0.0160.686 9±0.0110.628 1±0.010800.637 8±0.0150.765 4±0.0130.700 4±0.0190.643 0±0.011 11000.645 3±0.0080.778 4±0.0150.714 4±0.0080.650 4±0.013

2.1.5 不同pH荷葉中荷葉堿溶出度的測(cè)定[6-7]采用2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)制劑通則0931溶出度測(cè)定方法中第二法進(jìn)行測(cè)定。以脫氣pH 1.2，pH 4.5，pH 6.8，蒸餾水(試驗(yàn)中蒸餾水pH 6.79)900 mL為溶出介質(zhì)，溫度為(37.0±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，取荷葉細(xì)粉，置不同pH溶液中(平行三份)，漿降入溶出介質(zhì)中立即計(jì)時(shí)，至1，5，10，15，20，40，60，80，100 min時(shí)取樣2 mL，離心取上清經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)濾過(guò)，備用(同時(shí)補(bǔ)充同溫介質(zhì)2 mL及離心沉淀)。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定荷葉堿溶出量，計(jì)算累積溶出百分率，并繪制累積溶出曲線圖2。不同pH下粉體中荷葉堿溶出量見(jiàn)表2。

圖2 荷葉細(xì)粉在不同pH溶液中荷葉堿累積溶出曲線

2.1.6 Weibull分布參數(shù)的處理 分別以不同粒徑荷葉粉體2 h溶出量0.662 5，0.790 8，0.738 4，0.668 1 mg·g-1為荷葉粗粉、中粉、細(xì)粉、最細(xì)粉中荷葉堿100%溶出量。以細(xì)粉在不同緩沖溶液中2 h的溶出量3.005，1.200，0.539 9，0.738 4 mg·g-1作為pH 1.2，pH 4.5，pH 6.8，純水中的平衡溶出量[8-10]。

根據(jù)荷葉堿的累積溶出百分率，按照Weibull模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以X=lnt、Y=ln[-ln(1-F)]為變量(F為累積釋放百分?jǐn)?shù))，求得不同粒徑、不同pH下荷葉粉體中荷葉堿的溶出時(shí)間與累積溶出百分率的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表3。

并求出各溶出度參數(shù)T50、Td、Q45、m(T50：累計(jì)溶出50%的時(shí)間；Td：累積溶出63.2%的時(shí)間；Q45：45 min時(shí)的累積溶出率；m：曲線形狀參數(shù))，結(jié)果見(jiàn)表4。

不同粒徑荷葉粉體荷葉堿溶出量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，采用Weibull模型對(duì)數(shù)據(jù)處理，由擬合所得溶出度參數(shù)計(jì)算荷葉堿溶出速率。至各樣品溶出50%進(jìn)行考察，溶出速率：細(xì)粉>最細(xì)粉>中粉>粗粉；不同pH下，溶出速率為pH 6.8>水>pH 4.5>pH 1.2。

表2 不同pH下荷葉細(xì)粉中荷葉堿累積溶出量

注：水由超純水儀制備，pH 6.77。

表3 不同粒徑、不同pH荷葉粉體中荷葉堿溶出回歸方程(X=lnt，Y=ln[-ln(1-F)])

表4 不同粒徑、不同pH下荷葉粉速率溶出參數(shù)

注：T50：累計(jì)溶出50%的時(shí)間；Td：累積溶出63.2%的時(shí)間；Q45：45 min時(shí)的累積溶出率；m：曲線形狀參數(shù)。

圖3 不同粒徑荷葉堿溶出擬合曲線(X=lnt，Y=ln[-ln(1-F)])

2.1.7 相似因子法(f2)評(píng)價(jià)溶出曲線的相似 相似因子法為美國(guó)FDA推出的采用溶出曲線評(píng)價(jià)藥物內(nèi)在品質(zhì)的方法，計(jì)算公式如下：

(1)

Rt為參比制劑平均累積溶出量，Tt為t時(shí)間自制制劑的溶出度，n為取樣點(diǎn)數(shù)目(3≤n≤5，參比制劑累積溶出量大于85%的取樣點(diǎn)數(shù)目≤1)。若50≤f2<100，則認(rèn)為兩條溶出曲線相似[11]。荷葉細(xì)粉在pH 1.2鹽酸溶液，pH 4.5，pH 6.8磷酸緩沖溶液和水中f2分別為89.7，99.2，99.8(n=5)，表明各緩沖溶液中荷葉堿溶出行為與其在水中溶出行為具有相似性。

不同粒徑荷葉粉體在蒸餾水中溶出行為，粗粉與中粉、粗粉與細(xì)粉、粗粉與最細(xì)粉間的f2分別為99.84，99.85，99.97(n=5)，表明在蒸餾水中，各粒徑荷葉粉體中荷葉堿溶出規(guī)律與粗粉中荷葉堿溶出規(guī)律具有相似性。

3 討論

3.1 采用Weibull模型考察粒徑和pH對(duì)荷葉堿溶出規(guī)律結(jié)果

不同粒徑荷葉粉體中荷葉堿的溶出量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，溶出量為中粉>細(xì)粉>粗粉>最細(xì)粉。提示不同粒徑粗粉、中粉、細(xì)粉、最細(xì)粉荷葉堿體外溶出過(guò)程中宜將粒徑控制在適宜范圍，不宜過(guò)細(xì)，為藥材粉碎工藝提供參考。不同pH溶出介質(zhì)中，溶出量為pH 1.2>pH 4.5>水>pH 6.8，即隨pH的降低溶出量增大。

3.2 Weibull模型參考意義

不同pH溶出介質(zhì)中，荷葉中荷葉堿溶出量隨時(shí)間延長(zhǎng)增加。pH 4.5，pH 6.8，蒸餾水中細(xì)粉在60 min后荷葉堿溶出量增加趨于平緩，pH 1.2緩沖溶液中荷葉細(xì)粉中荷葉堿在80 min后溶出量趨于平緩。建立與溶出度有關(guān)的Weibull模型，具有一定參考意義，因Weibull模型只能描繪不能充分突出藥物溶出動(dòng)力學(xué)性質(zhì)[12]。試驗(yàn)中分別采用超聲、漿法對(duì)平衡溶出量進(jìn)行了測(cè)定，當(dāng)超聲測(cè)定所得溶出量與100 min時(shí)測(cè)得溶出量相差較大時(shí)，采用Weibull方程擬合所得曲線線性關(guān)系較差，故采用漿法120 min所得荷葉堿含量作為溶出量。從溶出量分析，荷葉粉體在所考察的溶出介質(zhì)經(jīng)2 h后溶出量不存在顯著性差異。

3.3 相似因子法(f2)評(píng)價(jià)溶出曲線的相似性

結(jié)果顯示各粒徑荷葉粉體中荷葉堿溶出行為與粗粉中荷葉堿溶出規(guī)律具有相似性；各緩沖溶液中荷葉堿溶出行為與荷葉堿在水中溶出行為具有相似性。