基因功能驗證研究方法淺述

賈舒安李 彥

(1.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二中學(xué)，新疆烏魯木齊 830002)

基因功能驗證研究方法淺述

賈舒安1李 彥2

(1.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二中學(xué)，新疆烏魯木齊 830002)

隨著遺傳學(xué)從宏觀到微觀水品的進展，分子水平上的研究不斷深入和推進，越來越多的基因被得以成功克隆，基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時代功能基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。本文對基因功能驗證研究的方法進行系統(tǒng)綜述。

遺傳學(xué)；功能基因驗證；基因功能

遺傳學(xué)從20世紀開始了由宏觀到微觀，由形態(tài)表型的描述逐步分解到生物體個體分子及功能的研究這一發(fā)展過程。1986年美國科學(xué)家Thomas Roderick提出了基因組學(xué)（Genomics），指對所有基因進行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)。因此，基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測序為目標的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics）和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學(xué)（functional genomics），又被稱為后基因組（postgenome）研究。鑒定復(fù)染性狀的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是現(xiàn)代遺傳學(xué)亟待解決的問題之一。

1 基因功能的研究方法

目前常用的基因功能的研究方法有：基因敲除，基因誘捕，生物芯片技術(shù)，基因過表達技術(shù)，RNA干擾等。

1.1 基因敲除（Gene knock-out）

技術(shù)是是一種遺傳工程技術(shù)，主要是利用DNA同源重組原理將外源基因精確地定點地整合到核基因組的特定位置上，最終達到改變細胞遺傳特性的目的。目前用于基因敲除的技術(shù)有FLPFRT系統(tǒng)、Cre/loxP系統(tǒng)等。該方法通過分析處理前后的細胞表觀變化分析整合基因的功能，同時通過系統(tǒng)地改變基因結(jié)構(gòu)也會導(dǎo)致相應(yīng)地改變，從而分析其蛋白產(chǎn)物各功能區(qū)的作用[1-3]。

傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴于細胞內(nèi)同源染色體的隨機交換，但單純的依靠同源重組實現(xiàn)基因組的永久修復(fù)幾率太低，這也大大阻礙了生物學(xué)研宄的全面發(fā)展。另外，由于胚胎重建技術(shù)發(fā)展緩慢導(dǎo)致大多數(shù)動物尚未建立胚胎干細胞系統(tǒng)，大動物基因敲除的發(fā)展受到很大限制。目前只有通過在體細胞中打勒并進行克隆可補彌上述缺陷、實現(xiàn)基因的定點整合，但由于同源重組發(fā)生的幾率低下（低于10-6）和體細胞擴增能力的極為有限，且在體外經(jīng)過長期、大量的藥物蹄選和培養(yǎng)過程，供體細胞易發(fā)生衰老，染色體同樣可能受到不同程度的損傷，所以大動物基因敲除模型獲得成功的報道目前并不多。

1.2 基因誘捕（gene trap）

是近幾年基于小鼠胚胎干細胞和一類報道載體發(fā)展起來的一種高通量的基因打IE技術(shù)?；蛘T捕基本原理是：通過基因誘捕載體導(dǎo)入外源DNA使的內(nèi)源DNA突變，并插入報告基因?？剐曰虻恼１磉_有利于陽性克隆的蹄選，同時報道基因表達產(chǎn)物可應(yīng)用于監(jiān)測內(nèi)源基因的表達。該技術(shù)通過插入使內(nèi)源基因表達終止，達到突變內(nèi)源基因的目的，可用于分析基因功能。另外，插入的報告基因可以利用整合位點改變基因的調(diào)控元件，模仿內(nèi)源基因的表達，使得內(nèi)源基因表達受抑制，達到突變內(nèi)源基因的目的，通過分析報告基因的時序表達特點，可用于研宄重組部分內(nèi)源基因的表達特性。

1.3 生物芯片技術(shù)

是指在固相基質(zhì)表面上通過微加工和微電子技術(shù)構(gòu)建的生物化學(xué)微型分析檢測系統(tǒng)，以實現(xiàn)對機體細胞、組織、糖類、蛋白質(zhì)、核酸以及其它成分快速、準確的檢測。依據(jù)研究對象的差異、探針分子的不同和制作工藝的發(fā)展，生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片等[4，5]。

基因芯片又稱DNA微陣列、DNA芯片，是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟以及最先實現(xiàn)商品化的技術(shù)?；蛐酒瑢⒋罅亢塑账崞危╟DNA、表達序列標簽或短DNA片段）有序的固定到固相支持物上，通過與樣品堿基互補，對核苷酸序列組成進行批量檢測。蛋白質(zhì)芯片也稱蛋白質(zhì)微陣列，是通過利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、底物與酶、蛋白質(zhì)與其它小分子之間的相互影響，監(jiān)測分析蛋白質(zhì)的一項技術(shù)。鑒于蛋白質(zhì)更難于在固相承載物表面合成，且其空間構(gòu)象易于改變而失去生物學(xué)活性，所以蛋白質(zhì)芯片較基因芯片更復(fù)雜。考慮到蛋白質(zhì)是基因表達的最終產(chǎn)物，雖然調(diào)控機制復(fù)雜，但是較于基因芯片更能全面地反映生命活動的本質(zhì)，因此其在基因功能研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

1.4 基因過表達技術(shù)

是將目的基因的全部的編碼區(qū)片段整合轉(zhuǎn)入特定的細胞中，進而根據(jù)細胞生物學(xué)行為的相應(yīng)變化，從而分析該外源基因的相應(yīng)功能，該方法是目前應(yīng)用最為廣泛、技術(shù)最成熟的功能驗證的技術(shù)手段之一?？紤]到基因的轉(zhuǎn)染效率和持續(xù)穩(wěn)定表達情況的影響，過表達載體系統(tǒng)的選擇需謹慎[6]。

目前常用的基因過表達載體系統(tǒng)分為非病毒性表達載體以及病毒性表達載體這兩種。非病毒性表達載體目前主要通過脂質(zhì)體介導(dǎo)、磷酸興共沉淀法、顯微注射法、電穿孔等方法將攜帶外源基因的目的質(zhì)粒導(dǎo)入到受體細胞中，最終實現(xiàn)目的基因在該細胞中的相應(yīng)的表達。盡管這類載體具有省時省力、操作簡便等優(yōu)勢，但是也存在一些局限性。主要面對的問題是：利用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定表達外源基因的細胞所需時間長、適用于增殖較快的細胞；不同細胞類型對外源DNA的攝取能力有所不同，尤其在對于原代細胞而言這種轉(zhuǎn)染方法幾乎是無效的。病毒載體以病毒穿梭顆粒為載體感染宿主細胞的技術(shù)，具有轉(zhuǎn)染效率高以及目的基因可穩(wěn)定表達等優(yōu)勢現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用，其中其特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代細胞。目前成功構(gòu)建的病毒載體具有獨特的特點，常用病毒載體有慢病毒載體、單純皰瘆病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒等，應(yīng)在實際應(yīng)用中綜合考慮細胞類型和實驗?zāi)康撵`活選擇適合的病毒載體，達到實驗?zāi)康摹Ｍ瑫r，選擇合適的強啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚腺苷酸信號等元件，均能使表達效率明顯提高。

1.5 RNA干擾（RNA interference，RNAi）

基于機體對外源雙鏈RNA具有抵抗機制的原理，在轉(zhuǎn)錄水平上實現(xiàn)的基因阻斷技術(shù)，是一種雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在mRNA水平上通過關(guān)閉相應(yīng)的祀基因表達或使其沉默的相關(guān)過程，即針對目的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。從提出至今，這項

技術(shù)己應(yīng)用于多個領(lǐng)域并取得了突飛猛進的發(fā)展。作為一種既簡單又有效的基因敲除替代的遺傳工具，RNA干擾技術(shù)大大加速了功能基因組學(xué)的研宄進展[7，8]，2001年該技術(shù)被Science評為十大科學(xué)進展之一，名列2002年十大科學(xué)技術(shù)進展之首，而后成為基因組學(xué)的一個熱門研宄領(lǐng)域。

隨著RNA干擾技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，該技術(shù)己經(jīng)在基因功能研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)通路研究、治療病毒感染、抗腫瘤等方面逐步開始應(yīng)用。除上述作用外，RNA干擾技術(shù)還可以用于提高藥物敏感性及福射敏感性，在臨床上為相關(guān)疾病的治療及新藥物的開發(fā)提供全新的方向。RNAi抑制基因表達具有高效性、特異性和實效性的特點。另外，RNAi是特定的己知基因序列，通過抑制目的基因的表達而實現(xiàn)基因功能或個體表型的改變，能夠特異性地抑制基因的表達來闡明基因在生物體中的功能，應(yīng)用前景廣闊，適用于基因功能驗證研宄。

2 TRIB家族

Tribbles（TRIBs）基因是在果蠅體內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶樣蛋白基因家族，是誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制有絲分裂的核基因[9]。在哺乳動物體內(nèi)有三種TRIBs基因家族成員：TRIB1、TRIB2和TRIB3。它們都含有70～100個氨基酸的N末端和25個氨基酸的C末端[10]。各個成員之間兩個末端的氨基酸序列不完全相同，但是它們的中間區(qū)都具有絲/蘇氨酸蛋白激酶的保守結(jié)構(gòu)域。Tribbles缺少ATP結(jié)合位點和激酶激活域，沒有可檢測到的激酶活性，因此被稱為假性激酶，或偽激酶。

2.1 TRIB3研就現(xiàn)狀

TRIB3是TRlBs家族成員之一，與家族其他成員相比具有更廣泛的生物學(xué)功能，在哺乳動物中表達水平高且在不同組織器官的表達水平存在明顯差異。在功能上被認為是一種調(diào)節(jié)蛋白，其通過泛素化或蛋白酶體降解從而調(diào)節(jié)其它蛋白的活性。TRIB3基因除參與細胞的增殖和分化外，與機體糖脂代謝也有著非常密切的聯(lián)系。雖然TRIB3沒有激酶活性，但實驗表明其能與多種細胞因子及核因子結(jié)合，在不同的細胞信號通路中發(fā)揮著或正或負的調(diào)控作用，從而參與應(yīng)激反應(yīng)、細胞生長和代謝過程。在哺乳動物中，TRIB3具有高水平表達且富于變化的特征，但是TRIB3在細胞中的確切功能還未被闡明。除參與細胞增殖、分化、腫瘤的發(fā)生外，與機體糖脂代謝的調(diào)節(jié)也密切相關(guān)。

Fang N[11]等人研究發(fā)現(xiàn)，TRIB3在誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER應(yīng)激）期間，能誘導(dǎo)NF-κB的活化和加重INS-1衍生的β細胞凋亡，從而抑制NF-κB途徑的反應(yīng)，來阻止β細胞凋亡，也就是說TRIB3通過NF-κB信號通路介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)β細胞的凋亡。

Tiit ?rd等人[12]研究發(fā)現(xiàn)，TRIB3 mRNA能強烈上調(diào)葡萄糖剝奪經(jīng)由由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）傳感器激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的誘導(dǎo)細胞激酶PERK。在缺乏葡萄糖條件下，細胞存活由TRIB3過表達增強，轉(zhuǎn)為TRIB3沉默，TRIB3上調(diào)基因是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（IGFBP2）。IGFBP2 mRNA表達下調(diào)的細胞中進行g(shù)lu-COSE剝奪，并減少IGFBP2表達，加重其過程中缺乏葡萄糖的細胞死亡，而過表達IGFBP2可延長細胞的存活。此外，IGFBP2沉默廢除TRIB3的促存活作用。數(shù)據(jù)表明，IGFBP2通過TRIB3的衰減加速了細胞凋亡。

Zhang LW等人[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠的腎臟和小鼠腎小球系膜細胞中，TRIB3的表達先增加，后降低，從而阻斷ERK1/2MAPK途徑，這可能表明TRB3與ERK1/2 MAPK之間是負反饋調(diào)節(jié)，或者存在其他特殊途徑。

Cui XG等人[14]，發(fā)現(xiàn)主要通過促進脂肪酸合成的限速酶乙醜輔酶A梭化酶（ACC）的泛素化并將其降解，導(dǎo)致脂質(zhì)合成減少，進一步促進脂肪分解。基因?qū)τ谌橹誀疃詾樨撜{(diào)控的作用。

功能基因組在評估和檢測藥物等方面時十分有效，因此也經(jīng)常用于醫(yī)藥，畜牧獸醫(yī)，生物工程工作和試驗中，應(yīng)用前景極其廣闊。在今后越來越多的研究中，相信功能基因的驗證能為遺傳學(xué)，特別是在基因功能研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

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賈舒安（1987—），男，山西臨汾市人，博士研究生，職位：助理獸醫(yī)師，從事實驗室診斷工作。