復(fù)方當(dāng)歸茶的體外抗氧化和體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性

吳國泰,張 琪,李 芳,王水明,王瑞瓊,任 遠(yuǎn)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000)

當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效,是傳統(tǒng)的常用中藥,具有治病防病、保健體質(zhì)和特色飲食等多種用途?，F(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸及其化學(xué)成分對機(jī)體造血、血液循環(huán)、神經(jīng)、免疫等多個(gè)系統(tǒng)具有廣泛的藥理作用[1-3]。富含當(dāng)歸的保健食品開發(fā)一直是全社會關(guān)注的熱點(diǎn),已經(jīng)注冊的當(dāng)歸保健食品在免疫調(diào)節(jié)、改善貧血、改善胃腸道功能、美容等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[4]。大量實(shí)驗(yàn)研究表明[5-8],當(dāng)歸、白術(shù)、大棗和蜂蜜及其成分具有確定的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性,其中主要的活性組分是多糖類和內(nèi)酯類物質(zhì)?；谝陨涎芯炕A(chǔ)并按照中醫(yī)配伍理論,用當(dāng)歸、白術(shù)、大棗和蜂蜜組成具有一定功能的保健食品配方,用傳統(tǒng)工藝制備具有食品特點(diǎn)的保健茶,既有理論依據(jù)又有科技創(chuàng)新,能有效滿足現(xiàn)代社會亞健康群體生活的需要,由當(dāng)歸配伍組成的保健食品也非常繁多,檢索1997年以來CFAD注冊成功的含當(dāng)歸的保健食品多達(dá)500余種,大都是大復(fù)方多功能。本研究擬定小復(fù)方,預(yù)期開發(fā)具有養(yǎng)顏潤腸功能的保健茶,在前期基礎(chǔ)上,從清除自由基和免疫調(diào)節(jié)的角度，闡述復(fù)方當(dāng)歸茶的保健作用,為進(jìn)一步開發(fā)復(fù)方當(dāng)歸保健食品,提高當(dāng)歸的經(jīng)濟(jì)社會價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

KM種小鼠 SPF級,240只,雌雄各半,體重20±2 g(6周齡),由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號SCXK(甘)2015-0001,動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號SYXK(甘)2015-0001-SPF級小鼠生長繁殖飼料 北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供;達(dá)正堂牌雪容口服液 廣州達(dá)正堂保健品有限公司;環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;硫酸(98%)、磷酸、水楊酸、FeSO4·7H2O、DPPH(1,1-二苯基-2-苦基苯肼) 化學(xué)純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;鉬酸銨(56.5%) 化學(xué)純,上海麥克林化學(xué)試劑廠,無水乙醇 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;Tris(99.5%) 化學(xué)純,西寶生物科技股份有限公司;鄰苯三酚 化學(xué)純,天津市凱通化學(xué)制劑有限公司;印度墨汁 CHROMA-GESELL-SCHAFTmbH&Co-D-48161 Munster;豚鼠血清 -20 ℃保存,臨用時(shí)生理鹽水1∶10稀釋;Alsever’s溶液、雞紅細(xì)胞(CRBC)懸液、姬姆薩染液 按文獻(xiàn)[9]方法配制。

CPA1003P型電子天平 德國Nestorius公司;UV-2401型紫外分光光度計(jì) 依瓦塔精密光電有限公司;METER PHS-430型pH計(jì) 西安禾普生物科技有限公司;YKH-Ⅱ型液體快速混合器 江西醫(yī)療器械廠;HH-601型超級恒溫水浴鍋 江蘇金壇市恒豐儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)方當(dāng)歸茶(CAT)的制備 處方:當(dāng)歸3 g、白術(shù)3 g、大棗4 g、蜂蜜8 g;參照中藥流浸膏的制備方法[10]。取當(dāng)歸、白術(shù)、大棗(破)處方100倍用量,加10倍量蒸餾水煎煮1 h,過濾,藥渣再加8倍量蒸餾水煎煮40 min,合并藥液濃縮至500 mL。取250 mL藥液加蜂蜜400 g,得流浸膏,蒸餾水定容至1000 mL,按200 mL分裝,流通蒸汽滅菌。推薦每日人用量40 mL,分2～3次溫水兌服。

1.2.2 體外抗氧化活性受試物的制備 取復(fù)方當(dāng)歸茶10.0 g溶于100 mL雙蒸水中,充分溶解,用雙蒸水稀釋制成不同濃度的溶液,用0.22 μm濾膜過濾,濃度依次為0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 mg/mL,待用;同時(shí)配制相同濃度的VC水溶液作為陽性對照。

1.2.3 總抗氧化活性的測定 參照文獻(xiàn)[11],取試管1只,依次加入1.0 mL(3.00 mol/L)的H2SO4溶液,1.0 mL(0.14 mol/L)的H3PO4溶液和1.0 mL(0.02 mol/L)鉬酸銨溶液,再用雙蒸水定容至5.0 mL搖勻。加塞于95 ℃水浴中加熱90 min。取出冷卻后,作為空白管備用。

另取試管14只,分別依次加入1 mL H2SO4、1 mL H3PO4、1 mL鉬酸銨,再依次加入1 mL不同濃度的受試物溶液和VC溶液,然后用蒸餾水定容到5 mL,加塞于95 ℃水中保溫90 min,取出冷卻后,用空白管溶液調(diào)零,在695 nm波長下測吸光度As,試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.4 清除DPPH自由基活性的測定 參照文獻(xiàn)[12],取試管14只,分別取2 mL不同濃度受試物溶液、2 mL 不同濃度VC溶液加入試管,再取2 mL DPPH乙醇溶液加入試管,混勻,室溫放置30 min。用無水乙醇做參比,在517 nm處測定吸光度Ai;取2 mL DPPH乙醇溶液和2 mL無水乙醇加入試管,混勻,在517 nm處測定吸光度Ac;另取試管14只,取2 mL不同濃度受試物溶液、2 mL不同濃度VC溶液加入試管,再取2 mL無水乙醇加入試管,混勻,室溫放置30 min,用無水乙醇做參比,在517 nm處測定吸光度Aj;各試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,計(jì)算DPPH自由基清除率和半數(shù)抑制率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

其中:Ai為加入受試物或VC的吸光度值,Aj為乙醇溶液的吸光度值,Ac為陰性對照吸光度值。

1.2.5 清除超氧陰離子自由基活性的測定 參照文獻(xiàn)[13],配制pH為8的250 mmol/L Tris-HCl緩沖液,取4.5 mL Tris-HCl緩沖液和4.2 mL蒸餾水加入試管,混勻,25 ℃水浴中恒溫靜置20 min,取出后立即加入25 ℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL(以10 mmol/L的HCl配制),迅速搖勻,倒入比色杯,在325 nm處,每隔30 s測定吸光度,計(jì)算每分鐘吸光度的增加值,試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

取試管14只,分別取2.0 mL不同濃度受試物溶液或不同濃度VC溶液、2.2 mL蒸餾水和4.5 mL Tris-HCl緩沖液加入試管,混勻,25 ℃水浴中恒溫靜置20 min,取出后立即加入25 ℃預(yù)熱的3 mmo1/L鄰苯三酚0.3 mL(以10 mmol/L的HCl配制),迅速搖勻,倒入比色杯,在325 nm處,每隔30 s測定吸光度,計(jì)算每分鐘吸光度的增加值,試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

空白管用10 mmol/L的HCl代替3 mmo1/L鄰苯三酚溶液,空白管調(diào)零,計(jì)算清除率和半數(shù)抑制率。

式(1)

其中:ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率,ΔA為加入受試物或VC溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.6 清除羥自由基活性的測定 參照文獻(xiàn)[14],取1 mL蒸餾水、1 mL 9 mmo1/L的 FeSO4和1 mL 9 mmo1/L的水楊酸-乙醇加入試管,混勻,再加入1 mL 8.8 mmo1/L的H2O2,37 ℃恒溫反應(yīng)0.5 h,以蒸餾水為參比,在510 nrn處測量吸光度A0。

分別取1 mL不同濃度的受試物溶液或VC溶液、1 mL 9 mmo1/L的 FeSO4和1 mL 9 mmo1/L的水楊酸-乙醇加入試管,混勻,再加入1 mL 8.8 mmo1/L的H2O2,37 ℃恒溫反應(yīng)0.5 h,以蒸餾水為參比,在510 nrn處測量吸光度AX。

分別另取1 mL不同濃度的受試物溶液或VC溶液、1 mL 9 mmo1/L的 FeSO4和1 mL 9 mmo1/L的水楊酸-乙醇加入試管,混勻,37 ℃恒溫反應(yīng)0.5 h,以蒸餾水為參比,在510 nrn處測量吸光度AX0。計(jì)算清除率和半數(shù)抑制率。

·OH自由基清除率(%)=(A0-Ax-Ax0)/A0×100

式(2)

其中:A0為空白液的吸光度,AX為加入受試物或VC溶液后的吸光度,AX0為不加顯色劑H2O2受試物溶液本底的吸光度。

1.2.7 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定 參照文獻(xiàn)[15],取小鼠60只,雌雄各30只,(20±2) ℃控溫和光暗周期各12 h環(huán)境,分性別飼養(yǎng),每籠5只,自由飲水,按性別體重隨機(jī)分為6組,設(shè)空白組(2%吐溫-80),模型組(CTX,2%吐溫-80),陽性組(達(dá)正堂牌雪容口服液1.67 g生藥/kg,用等效劑量法計(jì)算相當(dāng)于成人日用量的10倍),CAT高、中、低劑量組(12、6、3 g生藥/kg,用等效劑量法計(jì)算相當(dāng)于成人日用量的20、10、5倍),每組10只,按20 mL/kg體重容積灌胃給藥,空白組灌服等量的生理鹽水,每天1次,連續(xù)10 d。給藥第8 d除空白組外,其它各組均皮下注射 CTX(40 mg/kg),每天1次,共3 d。末次給藥后第2 d,各組小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞(CRBC)懸液(每只0.4 mL)。8 h后將小鼠頸椎脫臼處死,腹腔生理鹽水2.5 mL,抽取腹腔沖洗液滴片,37 ℃下孵育30 min,生理鹽水漂洗除去未貼片的細(xì)胞,晾干后以丙酮-甲醇液(1∶1)固定,姬姆薩染液染色,顯微鏡下每片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞,常規(guī)計(jì)算吞噬指數(shù)與吞噬百分率。

吞噬百分率(%)=吞噬CRBC的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞×100

吞噬指數(shù)=被吞噬的CRBC總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞

1.2.8 小鼠溶血素抗體的測定 參照文獻(xiàn)[16],分組及給藥同1.2.7項(xiàng),每天給藥1次,連續(xù)10 d。給藥第4 d,各組小鼠腹腔注射5% CRBC懸液(每只0.2 mL)進(jìn)行免疫。給藥第8 d除空白組外,其它各組皮下注射 CTX(40 mg/kg),每天1次,共3 d。末次給藥后第2 d,各小鼠股動脈取血于離心管中,室溫下放置1 h后以2000 r/min離心40 min。取血清,用生理鹽水稀釋100倍,取稀釋血清1 mL,與5% CRBC懸液0.5 mL、10%補(bǔ)體0.5 mL混合,37 ℃恒溫箱中保溫30 min,后于0 ℃冰箱終止反應(yīng)。離心(3500 r/min,15 min),取上清液于分光光度計(jì)(λ=540 nm)比色,以A值作為判定血清溶血素的指標(biāo)。

1.2.9 小鼠NK細(xì)胞活性的測定 參照文獻(xiàn)[17],分組及給藥同“1.2.7”項(xiàng),每天1次,連續(xù)10 d。給藥第2 d除空白組外,其它各組灌胃羥基脲(320 mg/kg),每天1次,共9 d。第11 d稱體重和脾臟濕重、檢測各組小鼠NK細(xì)胞活性。取脾臟后,用100目鋼網(wǎng)研磨脾臟制備細(xì)胞懸液,吸入離心管后靜置10 min,棄去沉淀的團(tuán)塊,Hanks液洗2遍,用完全RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)至所需濃度，作為小鼠NK活性的效應(yīng)細(xì)胞,每孔100μL標(biāo)記靶細(xì)胞1×105(YAC-1)與標(biāo)記同位素37 kBq混勻,37 ℃培養(yǎng)20～24 h,棄上清,加入DNA酶和胰酶各100 μL(分別含10 μg DNA和0.6 mg胰酶),充分混勻,放置1 h后收獲每管上清0.5 mL置另外的試管中。對照管以FCS-1640代替效應(yīng)細(xì)胞。用γ計(jì)數(shù)儀分別檢測每管上清和細(xì)胞部分的cpm值。

NK細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)管3H-TdR釋放率-對照管3H-TdR自然釋放率

1.2.10 小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的測定 參照文獻(xiàn)[18],分組及給藥同“1.2.7”項(xiàng),每天給藥1次,連續(xù)10 d。末次給藥后 24 h,小鼠尾靜脈注射印度墨汁(用 1% 明膠液稀釋 4 倍)0.1 mL/10 g體重。注射后用秒表計(jì)時(shí),分別在2、10 min時(shí)用毛細(xì)玻管從小鼠眼眶取血 25 μL,立即吹入 0. 1% Na2CO3溶液 2 mL 中,玻管于該液中吸入、吹出數(shù)次,以充分洗出玻管壁附著的血液,搖勻。以 0. 1% Na2CO3溶液調(diào)零,在675 nm 處測吸光度(A)。將小鼠頸椎脫臼處死,稱體重和肝、脾質(zhì)量,計(jì)算廓清吞噬指數(shù)(K)及校正吞噬系數(shù)(α)。

K=(lgA1-lgA2)/(t2-t1);α=體重/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)×K1/3

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CAT的總抗氧化活性

由圖1可知,CAT溶液具有確定的體外抗氧化活性,隨著受試物濃度的增加,總抗氧化活性逐漸增大,在受試濃度為2.5 mg/mL時(shí)活性進(jìn)一步增強(qiáng)。VC也有明顯的抗氧化活性,在較低濃度范圍(0.156～2.5 mg/mL),VC的總抗氧化活性明顯高于CAT,在較高濃度范圍內(nèi)(2.5～10.0 mg/mL),CAT的總抗氧化活性明顯高于VC。

圖1 復(fù)方當(dāng)歸茶體外總抗氧化活性(n=3)Fig.1 Total antioxidant activity in vitro of CAT(n=3)

2.2 CAT清除DPPH自由基的活性

由圖2可知,CAT、VC對DPPH自由基均有一定的清除能力,隨著受試濃度的增加,清除率逐漸增加,IC50分別為3.2226、4.8698 mg/mL;相對而言,CAT對DPPH自由基的清除能力大于 VC對DPPH自由基的清除能力。

圖2 復(fù)方當(dāng)歸清除DPPH自由基的活性(n=3)Fig.2 Scavenging DPPH free radical activities of CAT(n=3)

2.3 CAT清除自由基的活性

圖3 復(fù)方當(dāng)歸茶清除自由基的活性(n=3)Fig.3 Scavenging free radical activities of CAT(n=3)

2.4 CAT清除·OH自由基的活性

由圖4可知,復(fù)方當(dāng)歸茶、VC均具有一定的清除·OH自由基的作用,隨著受試物濃度的增加,清除率呈現(xiàn)增大的趨勢,IC50分別為20.8848、4.8130 mg/mL;相對而言,CAT對·OH自由基的清除能力大于 VC對·OH自由基的清除能力。

圖4 復(fù)方當(dāng)歸茶清除·OH自由基的活性(n=3)Fig.4 Scavenging ·OH free radical activities of CAT(n=3)

2.5 CAT對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,有多種功能,參與機(jī)體非特異性免疫和特異性細(xì)胞免疫,能夠吞沒和破壞受損組織,有助于啟動康復(fù)過程,以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對病原體進(jìn)行吞噬,并激活淋巴球或其他免疫細(xì)胞[19-20]。由表1可知,造模后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均極顯著下降(p<0.01),說明小鼠的巨噬細(xì)胞免疫功能受到了明顯的抑制;用CAT干預(yù)后,與模型組比較,陽性組、CAT高、中劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均有顯著升高(p<0.05);與陽性組比較,CAT各劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)無顯著性差異(p>0.05),結(jié)果提示CAT對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能具有促進(jìn)作用,具有一定的增強(qiáng)免疫活性。

表1 CAT對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(n=10)Table 1 Effect of CAT on the function of macrophage cell in abdominal cavity of mice(n=10)

2.6 CAT對小鼠溶血素抗體水平的影響

測定溶血素抗體水平是評價(jià)體液免疫反應(yīng)的一種經(jīng)典方法。由表2可知,造模后小鼠血清溶血素抗體水平極顯著下降(p<0.01),說明小鼠的體液免疫受到了明顯的損傷。用CAT干預(yù)后,與模型組比較,陽性組、CAT高劑量組小鼠血清溶血素抗體水平極顯著升高(p<0.01);與陽性組比較,CAT高劑量組小鼠血清溶血素抗體水平顯著增高(p<0.05),結(jié)果提示,CAT對小鼠的體液免疫具有一定的增強(qiáng)作用。

表2 CAT對小鼠溶血素抗體水平的影響(n=10)Table 2 Effect of CAT on hemolysinantibody levels in mice(n=10)

2.7 CAT對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

NK細(xì)胞是機(jī)體介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答的粒狀淋巴細(xì)胞,不依賴抗體和補(bǔ)體能夠識別靶細(xì)胞、殺傷介質(zhì),與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[21-22]。由表3可知,造模后小鼠NK細(xì)胞活性和脾臟指數(shù)均極顯著下降(p<0.01),說明NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答受到抑制,脾臟的免疫功能受損。用CAT干預(yù)后,與模型組比較,陽性組、CAT高、中劑量組小鼠NK細(xì)胞活性均有顯著升高(p<0.05),陽性組、CAT高劑量組小鼠脾臟指數(shù)均有顯著升高(p<0.05);與陽性組比較,CAT各劑量組小鼠NK細(xì)胞活性和脾臟指數(shù)無顯著性差異(p>0.05),結(jié)果提示CAT對小鼠NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和脾臟免疫功能均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

表3 CAT對小鼠NK細(xì)胞活性和脾臟指數(shù)的影響(n=10)Table 3 Effect of CAT on NK cell activityand the spleen index of mice(n=10)

2.8 CAT對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響

網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能檢測是綜合評價(jià)機(jī)體網(wǎng)狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞吞噬功能和免疫調(diào)節(jié)活性的傳統(tǒng)方法[23-24]。由表4可知,造模后K和α均極顯著下降(p<0.01),說明小鼠基于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬系統(tǒng)的肝臟和脾臟免疫功能受損,用CAT干預(yù)后,與模型組比較,陽性組、CAT高劑量組K和α均極顯著升高(p<0.01)，中劑量組K和α均顯著升高(p<0.05);與陽性組比較,CAT各劑量組K和α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),結(jié)果提示CAT能提高小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能,具有一定的增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

表4 CAT對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響(n=10)Table 4 Effect of CAT on the gobble up function of meshy endodermis system of mice(n=10)

3 結(jié)論