BTH處理對采后草莓果實還原勢和抗病性的調(diào)控作用

伍冬志,汪 立,廖云霞,陳 偲,汪開拓

(重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,重慶 404100)

草莓(Fragaria×ananassa)為多年生薔薇科草莓屬草本植物,在全球各地均有廣泛種植,其果實具有外觀鮮艷、口感圓潤、酸甜可口及滋味豐富等優(yōu)質(zhì)食用特征,且富含維生素、酚酸、花色苷及其他各種微量元素,營養(yǎng)價值較高[1]。但因草莓果實糖酸含量高,內(nèi)部組織柔軟多汁且無外皮屏障,故極易在貯運環(huán)節(jié)中受到病原真菌的侵染而發(fā)生大面積病害,造成嚴(yán)重?fù)p耗。B.cinerea是草莓果實中低溫貯運環(huán)節(jié)中最主要的病原菌[2];長期以來,施用化學(xué)殺菌劑可較好地控制B.cinerea在草莓果實表面的增殖,但多年連續(xù)使用化學(xué)殺菌劑可使病菌產(chǎn)生抗性,不僅降低了藥劑的防腐效果,還易導(dǎo)致嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留,直接危害人體健康并污染環(huán)境[3]。近年來的研究證實,茉莉酸及其甲酯、水楊酸、β-氨基丁酸、赤霉素或乙烯等綠色的植物內(nèi)源激素類激發(fā)子可通過激活草莓、葡萄、楊梅和藍(lán)莓等多種漿果類果實自身防衛(wèi)反應(yīng)來抵御灰霉菌或青霉菌的侵染,從而有效減少化學(xué)藥劑用量,因此逐漸受到關(guān)注[4]。

眾多轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[5]。研究表明,植物細(xì)胞內(nèi)部的還原勢可直接決定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能:植物眾多轉(zhuǎn)錄因子通常以低活性的共聚體形式存在,但當(dāng)植物受病菌脅迫或激發(fā)子誘導(dǎo)后,其細(xì)胞內(nèi)的還原勢迅速升高,可將轉(zhuǎn)錄因子中的二硫鍵還原為巰基,進(jìn)而產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)錄因子的活性單體,隨后在核定位信號的作用下由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中與病程相關(guān)(pathogensis-relatedproteins,PRs)基因特異性啟動子結(jié)合,最終激活PRs基因[6]。苯丙噻唑硫代乙酸甲酯(BTH)是非感光的功能性水楊酸類似物,可有效誘導(dǎo)水蜜桃[7]、葡萄[8]、香蕉[9]和芒果[10]等多種果實PRs基因的表達(dá)和植保素合成等抗病性反應(yīng),從而抑制病原菌侵染,但其中有關(guān)還原勢變化與誘導(dǎo)抗性之間的關(guān)聯(lián)仍不明確。實驗室前期研究已證實，0.1 mmol/L BTH處理可有效降低葡萄[8]和草莓果實[11]貯藏期間腐爛率,本研究以此為基礎(chǔ),分析BTH處理對抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)、磷酸戊糖(PPP)途徑的影響以及抗病性的誘導(dǎo)作用,以期發(fā)現(xiàn)草莓果實還原勢和抗病性的消長規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓果實(Fragaria×ananassacv. ‘Fengxiang’) 大小一致、轉(zhuǎn)色均勻并達(dá)到商業(yè)成熟度(八分熟),采摘于重慶市潼南區(qū)太安鎮(zhèn)有機草莓種植果園,隨后1 h內(nèi)運回實驗場所,挑出尚有破損及病斑果實,剩下果實仔細(xì)排列在實驗桌上于室溫下自然風(fēng)散去田間熱;BTH 美國Sigma-aldrich公司;谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定試劑盒、GSH-POD活性測定試劑盒、NADP+/NADPH含量測定試劑盒、還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)含量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;RNAprep Pure(多糖多酚植物總RNA提取)試劑盒 天根生化公司;SuperScript II試劑盒 美國Invitrogen公司;B.cinereaPers.:Fr菌株凍干粉 中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM)。

DW-86L338J型超低溫冰箱 海爾公司;UV2600i紫外可見分光光度計 日本島津公司;BSC-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;DYCP-31D型核酸電泳儀 北京六一儀器廠;PTC-200型RT-PCR儀器、Gel Doc XR型凝膠成像儀 美國伯樂公司;DW-86L338J型超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BTH處理和病原菌接種B.cinerea菌株凍干粉經(jīng)活化并傳代培養(yǎng)7 d后(25 ℃),用無菌生理鹽水(內(nèi)含0.02% Tween-80)提取孢子,用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)懸浮液中孢子濃度至5×104個/mL。

用75%乙醇溶液對上述已散去田間熱的草莓果實進(jìn)行表面消毒,隨后用無菌解剖針在果實直徑最大部位對稱穿刺2個孔(穿孔直徑2 mm,深度2 mm),再隨機分成四份:a. 對照組,用移液槍在草莓果實每個穿刺部位注入10 μL的無菌蒸餾水;b.B.cinerea接種組,用移液槍在草莓果實每個穿刺部位注入10 μL 5×104個/mL的B.cinerea孢子懸浮液;c. BTH處理組,用移液槍在草莓果實每個穿刺部位中注入10 μL 0.1 mmol/L的BTH溶液;d. BTH+B.cinerea接種組,草莓果實每個穿刺部位中先注入10 μL 0.1 mmol/L的BTH溶液,于20 ℃下貯藏 6 h后，再在各穿刺部位接種10 μL 5×104個/mL的B.cinerea孢子懸浮液。

以上操作溫度控制在(20±1) ℃。各處理完成后,將草莓果實每8個分裝于一個聚乙烯塑料盒中,在(20±1) ℃、90%±5% RH下貯藏5 d。每天觀察果實灰霉病發(fā)病狀況,并取健康果肉組織在液氮中速凍,-80 ℃下保存?zhèn)溆谩８魈幚戆?40顆果實,重復(fù)3次,整個實驗重復(fù)2次。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 發(fā)病率和病斑直徑 發(fā)病率(%)=(穿刺處出現(xiàn)霉菌性病害果實數(shù)/總果實數(shù))×100;病斑直徑用游標(biāo)卡尺直接進(jìn)行測量。

1.2.2.2 G6PDH和6PGDH活性的測定 稱取2 g果實凍樣,加入10 mL內(nèi)含30 mmol/L甘露醇、5 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl和1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2)仔細(xì)冰浴勻漿,再以5000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定酶活性。G6PDH和6PGDH活性參照indelá等[12]的方法進(jìn)行測定,以反應(yīng)液中每分鐘生成1 nmol NADPH為1個酶活力單位,以U/mg蛋白表示結(jié)果。

1.2.2.3 脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性的測定 稱取2 g果實凍樣,加入10 mL 內(nèi)含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L AsA和1%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)仔細(xì)冰浴勻漿,再以5000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定酶活性。參考Shigenaga等[13]方法測定DHAR和MDHAR活性,以反應(yīng)液在340 nm處吸光值每分鐘上升0.001為1個DHAR酶活性單位,以反應(yīng)液在265 nm處吸光值每分鐘上升0.001為1個DHAR酶活力單位,以U/mg蛋白表示結(jié)果。

1.2.2.4 谷胱甘肽還原酶(GR)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定 稱取2 g果實凍樣,加入7 mL內(nèi)含2 mmol/L EDTA和2 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2)仔細(xì)冰浴勻漿,再以5000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定酶活性。參考Cai等[14]方法用試劑盒測定GR(GSH還原法)活性;參考Xu等[15]方法測定APX活性,以反應(yīng)液在290 nm處吸光值每分鐘下降0.001為1個APX酶活性單位,結(jié)果以U/mg蛋白表示。

1.2.2.5 AsA和DHA、NADPH和NADP+以及GSH和GSSG含量的測定 AsA和DHA含量參考Kampfenkel等[16]方法進(jìn)行測定;NADPH和NADP+參考Nagano等[17]的硫酸甲酯吩嗪反應(yīng)法進(jìn)行測定(試劑盒法);GSH和GSSG參考Rahman等[18]的酶循環(huán)法,利用5,5′-二硫硝基苯甲酸反應(yīng)進(jìn)行測定(試劑盒法)。

1.2.2.6PRs基因表達(dá)豐度的測定 取1 g果實凍樣使用適合多糖多酚類樣品RNA提取的RNAprep Pure試劑盒進(jìn)行果實RNA的提取(4 ℃)。取1 mg RNA采取SuperScript II試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈,Oligo(dT)為引物。用Premier 7.0軟件設(shè)計相關(guān)基因特異性引物(表1)。以草莓18S rRNA基因為內(nèi)參。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)EB染色后，用凝膠成像儀掃描并定量分析[19]。

表1 草莓PRs基因特異性引物序列Table 1 Sequence of primers used for PRs genes in strawberries

1.3 數(shù)據(jù)分析

果實發(fā)病率和病斑直徑重復(fù)測定5次,其余指標(biāo)均重復(fù)測定3次。采取Duncan氏多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(SPSS 13.0),0.05和0.01分別表示顯著和極顯著差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實灰霉病的影響

由圖1可知,草莓果實在20 ℃貯藏時發(fā)病率及病斑直徑逐漸上升,至貯藏結(jié)束時,對照果實發(fā)病率達(dá)到39.8%,病斑直徑達(dá)3.72 mm;單一BTH處理有效抑制了果實腐爛的發(fā)生,貯藏5 d后果實發(fā)病率和病斑直徑分別較對照果實下降了56.3%和39.3%。接種病原菌B.cinerea后,草莓果實灰霉病癥狀急劇發(fā)展,貯藏5 d后果實發(fā)病率達(dá)到65.8%,病斑直徑達(dá)4.66 mm;BTH顯著抑制了果實貯藏期間由B.cinerea導(dǎo)致的灰霉病的發(fā)生(p<0.05),貯藏結(jié)束時果實發(fā)病率和病斑直徑分別較單一B.cinerea接種果實下降了74.2%和41.4%。

圖1 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實灰霉病發(fā)病率(A)和病斑直徑(B)的影響Fig.1 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on disease incidence(A)and lesion diameter(B)in strawberries during the storage for 5 days注:不同字母表示存在顯著性差異(p<0.05)。

2.2 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶活性的影響

由圖2可得,對照組草莓果實在20 ℃貯藏期間,其G6PDH活性在貯藏前3 d逐漸上升,隨后迅速下降;6PGDH活性則呈逐漸下降趨勢。相比于對照果實,B.cinerea接種顯著降低了G6PDH和6PGDH活性(p<0.05);而BTH處理則顯著誘導(dǎo)了G6PDH和6PGDH活性的上升(p<0.05),使G6PDH活性在整個貯藏期間以及6PGDH活性在貯藏后期均高于對照。經(jīng)BTH處理并接種病原菌的果實中G6PDH和6PGDH活性急劇上升,在整個貯藏期間均顯著高于單一BTH處理果實(p<0.05)。

圖2 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實G6PDH(A)和6PGDH(B)活性的影響Fig.2 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on activities of G6PDH(A)and 6PGDH(B) in strawberries during the storage for 5 days

2.3 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

由圖3可知,對照草莓果實中MDHAR、DHAR、GR和APX活性均隨貯藏時間的延長而呈緩慢下降趨勢,經(jīng)單一B.cinerea接種的果實中，MDHAR、DHAR和APX活性在整個貯藏期間緩慢下降(p<0.05),GR活性則在貯藏前4 d顯著低于對照果實(p<0.05)。BTH處理可延緩這四種AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶在貯藏期間活性的下降,使四種酶活性在整個貯藏期間均顯著高于對照水平(p<0.05)。BTH+B.cinerea接種處理較單一BTH處理更為顯著地誘導(dǎo)了GR和APX活性的上升(p<0.05),同時促使果實DHAR活性在貯藏后2 d顯著高于單一BTH處理(p<0.05);此外,經(jīng)BTH+B.cinerea接種果實中MDHAR活性與經(jīng)單一BTH處理果實相比無顯著差異(p>0.05)。

圖3 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間MDHAR(A)、DHAR(B)、GR(C)和APX(D)活性的影響Fig.3 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on activities of MDHAR(A)、DHAR(B)、GR(C)and APX(D)in strawberries during the storage for 5 days

2.4 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間NADPH和NADP+含量的影響

由圖4所示,對照草莓果實NADPH含量在貯藏前3 d緩慢上升,隨后逐漸下降;NADP+含量則在貯藏期間逐漸上升。經(jīng)單一B.cinerea接種的果實中NADPH在貯藏第1 d出現(xiàn)明顯上升,隨后急劇下降并顯著低于對照水平(p<0.05);同時,B.cinerea接種促進(jìn)了果實中NADP+的積累,使其在整個貯藏期間均顯著高于對照果實(p<0.05)。除貯藏第3 d外,BTH處理在這個貯藏期間均顯著誘導(dǎo)了果實中NADPH合成并降低了NADP+含量(p<0.05),而BTH+B.cinerea接種處理則較單一BTH處理更為顯著提高了NADPH含量并降低了NADP+含量(p<0.05)。

圖4 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間NADPH(A)和NADP+(B)含量的影響Fig.4 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on contents of NADPH(A)and NADP+(B) in strawberries during the storage period

2.5 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間GSH、GSSG、AsA和DHA含量的影響

如圖5可得,對照草莓果實中GSH含量在貯藏期間基本維持穩(wěn)定,GSSG和DHA含量則呈現(xiàn)緩慢上升趨勢,AsA含量在貯藏第1 d出現(xiàn)峰值,隨后逐漸下降。經(jīng)單一B.cinerea接種的果實中GSH和AsA含量在整個貯藏期間顯著低于對照果實(p<0.05);同時,B.cinerea侵染在5 d的貯藏周期內(nèi)均能顯著促進(jìn)果實中GSSG和DHA含量的上升(p<0.05),其中GSSG含量在貯藏期間顯著高于對照果實(p<0.05),而DHA則僅在貯藏前4 d顯著高于對照果實(p<0.05)。單一BTH處理和BTH+B.cinerea接種處理均能有效增加GSH和AsA含量，并抑制GSSG和DHA含量的上升,經(jīng)BTH+B.cinerea接種處理的果實中GSH在貯藏后期(3～5 d)顯著高于經(jīng)單一BTH處理的果實(p<0.05)。

圖5 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間GSH(A)、GSSG(B)、AsA(C)和DHA(D)含量的影響Fig.5 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on contents of GSH(A),GSSG(B),AsA(C)and DHA(D)in strawberries during the storage period

2.6 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間PRs基因表達(dá)豐度的影響

由圖6可知,經(jīng)單一B.cinerea接種的草莓果實PRs基因表達(dá)豐度在貯藏第1 d出現(xiàn)明顯峰值,其數(shù)值分別是對照水平的1.67、3.89、1.56和1.65倍,隨后迅速下降至對照水平。經(jīng)單一BTH處理的草莓果實中PRs基因表達(dá)豐度在貯藏第1 d與對照相比無顯著差異(p>0.05);但在貯藏第4、5 d,單一BTH處理顯著誘導(dǎo)了果實PRs基因表達(dá),使其豐度顯著(p<0.05)高于對照果實。BTH復(fù)合B.cinerea接種較單一B.cinerea接種或BTH處理更能促進(jìn)草莓果實PRs基因的表達(dá)豐度的提高,使果實中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu基因表達(dá)豐度整個貯藏期間均顯著(p<0.05)高于單一B.cinerea接種或BTH處理果實。

圖6 BTH處理和B. cinerea接種對草莓果實貯藏期間FaPR1(A)、FaPR5(B)、FaCHI-1(C)和Faβglu(D)基因表達(dá)豐度的影響Fig.6 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on gene expression levels of FaPR1(A),FaPR5(B),FaCHI-1(C)and Faβglu(D)in strawberries during the storage period

3 討論

與水楊酸(SA)的作用模式類似,BTH也被認(rèn)為是一種高效激發(fā)子可直接激活植物超敏反應(yīng)以形成SAR抗性[20]。最新研究表明,低濃度BTH處理誘導(dǎo)的植物Priming反應(yīng)可在病原菌侵入時啟動活性氧迸發(fā)、植保素合成以及PRs基因表達(dá)等一系列抗病性反應(yīng)[21],以使植物免遭病原菌侵害。本研究經(jīng)0.1 mmol/L BTH處理后,草莓果實中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu等PRs基因表達(dá)量在貯藏前期無顯著升高,貯藏后期草莓發(fā)病率逐漸上升,基因表達(dá)豐度也顯著增加。果實先經(jīng)BTH處理再接種病原菌B.cinerea后,其PRs基因豐度立即顯著增加(p<0.05)并持續(xù)維持在較高水平。這說明，0.1 mmol/L BTH誘導(dǎo)的草莓果實抗病性反應(yīng)是一種典型的Priming反應(yīng)模式;通過該抗性模式,草莓果實可在遭受B.cinerea侵染時迅速啟動防衛(wèi)反應(yīng),激活PRs基因,從而控制灰霉病癥狀的進(jìn)一步發(fā)展。這與前期研究結(jié)果類似,低濃度的BTH處理(0.01或0.1 mmol/L)可誘導(dǎo)葡萄果實的Priming反應(yīng),從而使果實在接種病原菌后迅速展現(xiàn)抗性[8]。

在誘導(dǎo)抗性網(wǎng)絡(luò)中,提高植物內(nèi)部還原勢是激活植物防衛(wèi)反應(yīng)的重要步驟。對擬南芥WRKYs、GIPs和NPRs等轉(zhuǎn)錄因子的研究表明,在植物未受到病原菌侵染或激發(fā)子處理時,植物細(xì)胞中還原勢較低,轉(zhuǎn)錄因子多以二硫鍵鍵合為共聚體的無活性形式存在;但當(dāng)植物受到病原菌侵染開始啟動防衛(wèi)反應(yīng)時,植物細(xì)胞內(nèi)還原勢急劇上升,從而將轉(zhuǎn)錄因子共聚體中的二硫鍵還原為巰基,釋出具有活性的轉(zhuǎn)錄因子單體,最終誘導(dǎo)下游PRs基因的表達(dá)[22-24]。NADPH、GSH和AsA是植物細(xì)胞中主要的還原性物質(zhì),其含量的高低直接決定還原勢[25]。PPP途徑是植物糖代謝支路,其可將NADP+還原為NADPH,G6PDH和6PGDH是該途徑的限速酶類[26];AsA-GSH循環(huán)可將GSSG和DHA還原為GSH和AsA,MDHAR、DHAR、GR和APX是該途徑的關(guān)鍵酶類[27]。PR1基因是植物抗病性反應(yīng)的特定標(biāo)記基因,可直接反映防衛(wèi)反應(yīng)水平的高低;FaPR5基因是草莓與抗病相關(guān)的類甜蛋白的編碼基因;FaCHI-1和Faβglu基因經(jīng)表達(dá)后可合成幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶,水解真菌細(xì)胞壁[28]。在本研究中,B.cinerea侵染顯著抑制了草莓果實PPP途徑關(guān)鍵酶G6PDH和6PGDH活性以及AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶MDHAR、DHAR、GR和APX活性,從而導(dǎo)致還原性物質(zhì)NAPDH、GSH和AsA逐漸氧化為NADP+、GSSG和DHA,同時果實中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu基因表達(dá)豐度也顯著下降。這說明草莓果實灰霉病的發(fā)展與果實內(nèi)部還原勢的降低密切相關(guān);BTH可有效誘導(dǎo)草莓果實PPP途徑和AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性的上升,提升NAPDH、GSH和AsA含量,提高果實還原勢從而促進(jìn)PRs基因表達(dá),最終降低果實發(fā)病率。

4 結(jié)論

0.1 mmol/L BTH處理誘導(dǎo)草莓果實抗病性反應(yīng)屬于Priming模式,可使果實在接種B.cinerea病原菌后迅速展現(xiàn)抗性。BTH處理可誘導(dǎo)草莓果實還原性物質(zhì)的積累,提高果實還原勢,從而激活PRs基因,最終提高果實抗病性，抑制B.cinerea導(dǎo)致的灰霉病的發(fā)生。