布魯氏菌抗體檢測(cè)試紙條的研制和初步比較

齊安生，邵 鈺，宮楓舉，張興進(jìn)，張如民，朱紹輝，孫學(xué)強(qiáng)，3

（1. 黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江哈爾濱 150069；2. 青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；3. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 2660322）

布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）侵入機(jī)體，引起傳染變態(tài)反應(yīng)性的人獸共患細(xì)菌性傳染病[1]。本病發(fā)現(xiàn)至今已有130多年歷史，不僅沒(méi)有被消滅，近年來(lái)還有逐年上升的趨勢(shì)。該病分布廣泛，在全世界范圍內(nèi)流行。布魯氏菌病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）須通報(bào)動(dòng)物疫病，為我國(guó)二類動(dòng)物疫病[2]。布魯氏菌能感染人、多種家畜和野生動(dòng)物，引起發(fā)熱、流產(chǎn)、睪丸炎、關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損傷等臨床癥狀，嚴(yán)重危害人類健康與畜牧業(yè)發(fā)展，并且威脅公共衛(wèi)生與食品安全，在國(guó)際貿(mào)易檢疫中為必檢傳染病之一[3]。

布魯氏菌為革蘭氏陰性菌，是一種胞內(nèi)寄生的球形或短桿狀菌，無(wú)鞭毛和莢膜，不形成芽孢。布魯氏菌是專性需氧菌，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，最適pH 6.6～7.4[4]。布魯氏菌分為光滑型（Smooth，S）和粗糙型（Rough，R）菌落，也有S-R中間型菌落。S型細(xì)菌中細(xì)胞壁含有O鏈的LPS，而R型LPS中O鏈缺失[5]。根據(jù)宿主特異性，布魯氏菌屬分為6個(gè)種，分別是流產(chǎn)布魯氏菌（牛種）、馬爾他布魯氏菌（羊種）、豬布魯氏菌、綿羊布魯氏菌、犬布魯氏菌和沙林鼠布魯氏菌。最近又發(fā)現(xiàn)了6個(gè)新的布魯氏菌種，分別是鯨型布魯氏菌（B. ceti）、鰭型布魯氏菌（B. pinnipedialis）[6]、田鼠種布魯氏菌（B. microti）[7]、岐見(jiàn)瑪瑙寶螺種布魯氏菌（B.inopinata，又名意外布魯氏菌，指意外在人類身上發(fā)現(xiàn)）[8]、狒狒種布魯氏菌（B. papionis）[9]、赤狐種布魯氏菌（B. vulpis）[10]。布魯氏菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分屬內(nèi)抗原和屬外抗原[4]。屬內(nèi)抗原包括A、M和R等表面抗原。S型布魯氏菌的抗原決定簇主要位于LPS的多糖鏈部分，為A和M兩種表面抗原。LPS是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要有效成分，O鏈在血清學(xué)診斷中起重要作用[5]。R型布魯氏菌共同具有R抗原。S型布魯氏菌表面抗原與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9、霍亂弧菌和大腸桿菌O157間有共同抗原成分[4]。

21世紀(jì)以來(lái)，隨著畜牧業(yè)發(fā)展，布魯氏菌病在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出快速回升趨勢(shì)。布魯氏菌病疫情在全球分布廣泛，約有1/5的人口受到該病威脅，每年新發(fā)病例約50萬(wàn)[11]。據(jù)有關(guān)數(shù)字統(tǒng)計(jì)，我國(guó)在1996-2017年，人的布魯氏菌病感染率從0.09/100 000上升到2.79/100 000，是原來(lái)的31倍。人感染率的增加預(yù)示著動(dòng)物疫情的加重[12]。我國(guó)近年來(lái)的布病呈現(xiàn)老疫區(qū)死灰復(fù)燃，新疫區(qū)范圍持續(xù)擴(kuò)大，疫情小規(guī)模、多點(diǎn)散發(fā)的特點(diǎn)[11]。我國(guó)《獸醫(yī)公報(bào)》的數(shù)據(jù)顯示，2011年我國(guó)家畜布魯氏菌病發(fā)病125 030例，2012年發(fā)病28 958次，2015年23個(gè)省份發(fā)病[13]。因此，研制快速便捷的抗體檢測(cè)試紙條，加強(qiáng)動(dòng)物布魯氏菌病抗體水平監(jiān)測(cè)特別必要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

布魯氏菌脂多糖（LPS）：本實(shí)驗(yàn)室提??；布魯氏菌，牛羊陽(yáng)性血清、陰性血清，大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結(jié)核病陽(yáng)性血清：中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供。布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原：購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、PVC膠板：購(gòu)自上海金標(biāo)生物；SPA、氯金酸：均為西格瑪產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌LPS的提取及純化 采用熱酚法提取，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.2 膠體金探針的制備 采用檸檬酸三鈉還原法，制備膠體金溶液。膠體金標(biāo)記的蛋白為金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）。具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.3 SPA多克隆抗體的制備與純化 質(zhì)控線抗原采用SPA免疫的兔血清。將SPA免疫健康兔，免疫3次后，采血，析出血清。血清的純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法。具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.4 試紙條的制備

1.2.4.1 質(zhì)控線（C線）與檢測(cè)線（T線）的劃線條件優(yōu)化 對(duì)NC膜上的C線和T線分別設(shè)置幾個(gè)濃度梯度，進(jìn)行劃膜濃度摸索，確定劃膜濃度后，對(duì)包被條件從緩沖液、劃膜速度和劃膜寬度進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4.2 質(zhì)控線（C線）與檢測(cè)線（T線）的劃線方法 首先，將2.5 cm寬的NC膜貼在PVC膜的中間對(duì)應(yīng)位置。將純化好的SPA多克隆抗體按照摸索好的稀釋濃度稀釋后，裝入金標(biāo)劃膜儀的噴頭1，將提取的LPS，按照摸索好的稀釋濃度稀釋后，裝入金標(biāo)劃膜儀的噴頭2；C線與T線之間的距離設(shè)置為4 mm，將貼在PVC板上的NC膜，固定在劃膜儀的合適位置，按開(kāi)始鍵，進(jìn)行劃線。將包被好抗原的PVC板放于37 ℃溫室中干燥2 h后，放密封袋中保存。

1.2.4.3 試紙條的組裝與斬切 在相對(duì)濕度控制在30%的溫室中，進(jìn)行試紙條組裝。取出包被有抗原的PVC板，取3.3 cm寬的吸水紙壓NC膜上端2 mm，小心抹平，黏緊。0.6 cm寬的金標(biāo)墊上端壓NC膜上端1 mm，1.9 cm寬的樣品墊上端壓金標(biāo)墊下方一半，每貼一種都要抹平黏緊。最后，在吸水紙上貼上綠色膠條，在金標(biāo)墊上貼藍(lán)色MAX膠條，包裝完成。用高速斬切機(jī)切成3 mm寬的試紙條，加入干燥劑，放入鋁箔袋密封保存。

1.2.4.4 試紙條的結(jié)果判定 將試紙條放入稀釋好的血清樣品中，樣品用量不可超過(guò)MAX線，室溫下作用5～10 min，觀察結(jié)果。質(zhì)控線和檢測(cè)線均顯色，則為布魯氏菌抗體陽(yáng)性；如果只有質(zhì)控線顯色，則為陰性；質(zhì)控線不顯色，該試紙條無(wú)效。

1.2.5 試紙條的鑒定

1.2.5.1 試紙條的敏感性檢測(cè) 布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（4 000 IU/mL）用生理鹽水做倍比稀釋后用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)的血清最高稀釋度作為試紙條的敏感性。

1.2.5.2 試紙條的特異性檢測(cè) 同一批次試紙條分別檢測(cè)牛羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清和陰性血清各2份，大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結(jié)核病陽(yáng)性血清各1份，觀察其特異性。

1.2.5.3 試紙條的重復(fù)性檢測(cè) 取同一批次及不同批次制作的試紙條分別檢測(cè)同樣的布魯氏菌病陰陽(yáng)性血清，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.2.5.4 試紙條的穩(wěn)定性檢測(cè) 取密封后置于室溫環(huán)境下保存3、6、9、12、15個(gè)月的試紙條進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)試紙條的穩(wěn)定性。

1.2.6 試紙條與虎紅平板試驗(yàn)比對(duì) 待檢血清樣品60份、陽(yáng)性血清30份，包括15份牛血清和15份羊血清，陰性血清30份，包括15份牛血清和15份羊血清，分別采用該兩種方法，對(duì)60份樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)二者符合率。

2 結(jié)果

2.1 膠體金表征分析

采用檸檬酸三鈉還原氯金酸方法制備的膠體金溶液，在其他反應(yīng)條件不變的情況下，濃度為0.01%氯金酸溶液中加入的檸檬酸鈉量與形成的膠體金顆粒大小呈反比，當(dāng)在100 mL體系內(nèi)快速加入1.5 mL 1%檸檬酸三鈉時(shí)，制備的膠體金顆粒大小約為25 nm。制備的膠體金在自然光照下呈酒紅色，清澈透亮。制備的膠體金顆粒呈球形，分散性較好，顆粒大小均一（圖1）。

圖1 膠體金顆粒電鏡圖片

2.2 試紙條的制備

2.2.1 C線和T線條件優(yōu)化 對(duì)NC膜上的C線和T線分別設(shè)置幾個(gè)濃度梯度，進(jìn)行劃膜濃度的摸索，確定劃膜濃度后，對(duì)包被條件從緩沖液、劃膜速度和劃膜寬度進(jìn)行優(yōu)化。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 C線和T線條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.2 試紙條的組裝 按照1.2.4.3的方法將試紙條組裝，使用時(shí)按照1.2.4.4方法判定。

2.3 試紙條的鑒定

2.3.1 敏感性檢測(cè) 布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（4 000 IU/mL）用新生牛血清進(jìn)行倍比稀釋后用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示最低檢出量為0.5 IU/mL（圖2）。

2.3.2 特異性檢測(cè) 用膠體金試紙條檢測(cè)牛羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清和陰性血清各2份，大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結(jié)核病陽(yáng)性血清各1份。結(jié)果顯示，陽(yáng)性血清均為陽(yáng)性，陰性血清均為陰性，其他交叉菌均為陰性（圖3）。

圖2 試紙條敏感性檢測(cè)結(jié)果

圖3 試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性檢測(cè) 用同一批試紙條檢測(cè)10份陰性血清和10份陽(yáng)性血清，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果一致。用3個(gè)不同批次試紙條分別檢測(cè)10份陰性血清和10份陽(yáng)性血清，結(jié)果一致。

2.3.4 穩(wěn)定性檢測(cè) 于室溫環(huán)境下保存一批試紙條，分別于3、6、9、12、15個(gè)月，用同一批血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)保存15個(gè)月的試紙條顯色強(qiáng)度稍有減弱，仍能進(jìn)行結(jié)果判定。

2.3.5 試紙條與虎紅平板試驗(yàn)比對(duì) 待檢血清樣品共60份，陽(yáng)性血清30份，包括15份牛血清和15份羊血清；陰性血清30份，包括15份牛血清和15份羊血清。分別采用上述兩種方法對(duì)60份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與虎紅平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為96.67%，總符合率為98.33%（表2）。

表2 試紙條與虎紅平板凝集試驗(yàn)比對(duì)結(jié)果

3 討論

布魯氏菌能引起人、家畜和多種野生動(dòng)物患病，給畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[16]，對(duì)人的健康造成重大的威脅，導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

通過(guò)對(duì)血清抗體的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，最早出現(xiàn)的抗體為IgM，隨后是IgG，再后是IgA，持續(xù)1年左右開(kāi)始下降；當(dāng)病情反復(fù)發(fā)作時(shí)，IgG又可以迅速回升[1]。

我國(guó)動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646-2002）介紹了4種布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法，分別是虎紅平板凝集試驗(yàn)、乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。其中，前兩種方法適用于家畜布魯氏菌病田間篩選試驗(yàn)和乳牛場(chǎng)布魯氏菌病監(jiān)測(cè)及診斷的初篩試驗(yàn)，后兩種方法為我國(guó)動(dòng)物布魯氏菌病的確診方法[17]。2018年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃中也提議，布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)、OIE推薦的間接ELISA和熒光偏振試驗(yàn)常被用于布魯氏菌病的初篩，試管凝集試驗(yàn)或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)或OIE推薦的競(jìng)爭(zhēng)ELISA為布魯氏菌病的確診方法[18]。而在上述所提到的用于初篩的方法中，虎紅平板凝集試驗(yàn)由于操作簡(jiǎn)單、成本低廉，被廣泛使用。但該方法結(jié)果判定主觀性強(qiáng)，主觀差異性較大。乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)只適用于奶牛，且操作方法復(fù)雜；熒光偏振方法需要特定的儀器設(shè)備，且價(jià)格昂貴，難以在基層中推廣使用。布魯氏菌病的臨床診斷更傾向于一種簡(jiǎn)便、快速、不需要特殊儀器設(shè)備，適用于臨床高通量檢測(cè)的診斷方法。膠體金試紙條憑借其操作方便和判定迅速的優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物疫病檢測(cè)中已得到較廣泛的應(yīng)用[19]。目前國(guó)內(nèi)取得新獸藥證書(shū)的布魯氏菌抗體檢測(cè)試紙條有2017年中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所聯(lián)合3家生物制品公司申報(bào)的布魯氏菌抗體檢測(cè)試紙條，為一類新獸藥（農(nóng)業(yè)部公告號(hào)2526）。該產(chǎn)品申報(bào)名稱雖然為試紙條，但是以檢測(cè)卡的形式，采用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理，特異性較高，但靈敏度稍差，漏檢概率較大。

本研究采用的是布魯氏菌抗體檢測(cè)試紙條，利用了間接法免疫層析原理，對(duì)國(guó)家陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出量能達(dá)到0.5 IU/mL，和文中有可能存在交叉的血清均沒(méi)有交叉現(xiàn)象，靈敏度和特異性均較高，和虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率高達(dá)98%，并且以試紙條形式，可以直接插入稀釋好的待檢樣品中，根據(jù)判定結(jié)果被時(shí)間直接讀取結(jié)果，簡(jiǎn)單方便快捷。但是，不可否認(rèn)的是，相比虎紅平板凝集試驗(yàn)，價(jià)格成本相對(duì)較高；其次，由于在研制過(guò)程中，沒(méi)有加入濾血墊，因此不能進(jìn)行全血檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究進(jìn)行了試紙條的敏感性和特異性試驗(yàn)，并與虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行了比對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果標(biāo)明該試紙條敏感性高、特異性好，且與虎紅平板凝集試驗(yàn)具有很高的符合率，可替代虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原用于布魯氏菌病初篩。下一步有待于擴(kuò)大樣本數(shù)，進(jìn)行進(jìn)一步考核，同時(shí)還有待于臨床試驗(yàn)和實(shí)踐檢驗(yàn)。