南瓜花藥培養(yǎng)影響因素研究

張瑞霞，李海峰，馮迎娥，李靜

（1.河南省安陽農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 安陽 455000；2.河南省安陽市湯陰縣五陵鎮(zhèn)人民政府，河南 安陽 455000）

近年來南瓜作為一種具有天然營養(yǎng)與保健功能的蔬菜，得到了人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?，特別是對(duì)于南瓜育種的研究。近年來，隨著生物技術(shù)育種的不斷發(fā)展，常規(guī)育種的不足在實(shí)際工作中日漸明顯，而單倍體育種因其能通過直接加倍得到純合二倍體受到了科研工作者的青睞。南瓜為異交植物，天然雜交率高，在常規(guī)育種中利用自交的方法獲得一個(gè)純系需要多代繁育，從而使育種、雜種一代的利用和良種繁育工作加長了周期和應(yīng)用年限，而單倍體育種正好可以彌補(bǔ)這點(diǎn)不足，但由于影響因素較多，所以單倍體育種還未得到廣泛的應(yīng)用。為了進(jìn)一步加快南瓜育種進(jìn)程以及使單倍體育種應(yīng)用于南瓜生產(chǎn)，本試驗(yàn)以葫蘆科南瓜屬中的南瓜優(yōu)選自交系10-4-25的花藥為試驗(yàn)材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，旨在對(duì)影響南瓜花藥培養(yǎng)的因素及培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐變、污染現(xiàn)象作初步研究，從而為南瓜屬蔬菜單倍體育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為南瓜優(yōu)選自交系10-4-25（100粒種子），由安陽市農(nóng)科院提供。于2017年春季定植于安陽農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

選用MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基，兩種培養(yǎng)基均附加蔗糖3%、瓊脂0.6%以及外源激素NAA、6-BA、2,4-D，pH值均為5.8。其中MS-N培養(yǎng)基配制時(shí)去掉了NH4NO3、KNO3等元素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)了9組激素配比方案，進(jìn)行最優(yōu)激素組合試驗(yàn)，每組5個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.2 花藥消毒與接種

試驗(yàn)采用0.1%HgCl2和2%次氯酸鈉兩種消毒劑對(duì)南瓜花藥進(jìn)行消毒處理。從田間采集南瓜花蕾（長2.93cm、粗0.89cm），將花蕾置于黑暗條件下，分別低溫（4℃）預(yù)處理24h和48h。用75%酒精浸泡30s后，取出用無菌水清洗1～2次，放入0.1%HgCl2中消毒7min或放入2%次氯酸鈉中消毒10min，然后取出再用無菌水沖洗4～5次。在無菌條件下，剝?nèi)セò辏瑢⒒ㄋ幏謩e接種于預(yù)先配制好的MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)花蕾的花藥。接種方式為將花藥平放于培養(yǎng)基上，讓花藥與培養(yǎng)基充分接觸。花藥接種后，放入培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)3d后開始觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒試劑、消毒方法對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

在南瓜花藥培養(yǎng)中，只有滅菌徹底才能將培養(yǎng)工作進(jìn)行下去。前人的工作大多是采用0.1%HgCl2滅菌，由于南瓜花蕾大，且雨后采集的花蕾更易受污染。本試驗(yàn)對(duì)比了不同消毒劑、消毒方法對(duì)花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果見表1無論采用何種消毒劑，用手剝?nèi)』ㄋ幭镜母腥韭首罡?，直接消毒花藥的次之，用刀劃開花蕾取出花藥消毒的最低。另外，0.1%HgCl2消毒7min，污染率高，且效果較差；用2%次氯酸鈉消毒10min，污染率低消毒效果也較好。

2.2 培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

不同培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果見表2（見下頁）。由表可以看出：MS培養(yǎng)基出現(xiàn)愈傷的效果好于MS-N培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基的褐變率高于MS-N培養(yǎng)基，為50.7%，MS-N培養(yǎng)基雖然褐變率相對(duì)較低，但是卻發(fā)現(xiàn)接種后的花藥出現(xiàn)了直接發(fā)白死亡的現(xiàn)象。初步分析，這種現(xiàn)象可能是培養(yǎng)基中缺少有利于植物生長的氮元素的緣故。這方面的研究工作還有待于進(jìn)一步的深入。

表1 不同消毒試劑、消毒方法的比較Table 1 Comparison of different disinfection reagents and disinfection methods

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)花藥的影響Table 2 Effect of different media on anther

表3 不同培養(yǎng)組合對(duì)花藥的影響Table 3 Effects on anther of different culture combinations

2.3 不同培養(yǎng)基組合的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了9組試驗(yàn)組合。試驗(yàn)過程中根據(jù)實(shí)際條件設(shè)計(jì)了每組5個(gè)培養(yǎng)皿，共45個(gè)培養(yǎng)皿，且每組的前2個(gè)培養(yǎng)皿所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，后3個(gè)培養(yǎng)皿為MS-N培養(yǎng)基。

根據(jù)表3的9組組合方案兩種培養(yǎng)基進(jìn)行花藥培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明：組合5的方案較好，接種于MS和MS-N培養(yǎng)基上的花藥均出現(xiàn)了愈傷（但隨后該愈傷發(fā)生了褐化死亡），按其他組合方案將花藥接種于不同的培養(yǎng)基后雖也有個(gè)別愈傷出現(xiàn)，但總體表現(xiàn)為不同程度的褐化現(xiàn)象，這可能與培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度有關(guān)。

2.4 外植體不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

表4顯示了不同預(yù)處理方法對(duì)南瓜花藥的影響，由表4可知，經(jīng)低溫（4℃）預(yù)處理24h、48h后，用南瓜花藥進(jìn)行培養(yǎng)，都能出現(xiàn)一定的膨大現(xiàn)象。經(jīng)過低溫預(yù)處理24h和未經(jīng)任何預(yù)處理的花藥獲得的愈傷組織誘導(dǎo)率基本上為0。48h的低溫預(yù)處理，經(jīng)過12d的培養(yǎng)后，有4個(gè)花藥長出了愈傷組織。隨著培養(yǎng)時(shí)間地延長，膨大后的花藥逐漸變褐，其中有些花藥接種后直接發(fā)白死亡。

由此可以看出，處理時(shí)間越長，誘導(dǎo)率越高，但是褐化也越嚴(yán)重。因此要注意選擇適宜的預(yù)處理時(shí)間，從而來提高外植體的存活率。

表4 不同預(yù)處理對(duì)花藥的影響Table 4 Effects of different pretreatment on anther

花藥在離體培養(yǎng)前進(jìn)行低溫預(yù)處理，適宜的低溫預(yù)處理可以提高愈傷組織和胚狀體的形成，并進(jìn)一步促進(jìn)植株的再生。在4℃低溫條件下，分別進(jìn)行預(yù)處理24h、48h以及未經(jīng)任何預(yù)處理3種方案的研究表明，4℃、48h的預(yù)處理方式中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了花藥愈傷組織，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，花藥逐漸變褐，直至死亡。因此，對(duì)于低溫預(yù)處理的合適時(shí)間和合適溫度尚待繼續(xù)深入研究。

3 小結(jié)

3.1 南瓜花藥培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)率偏低

從試驗(yàn)結(jié)果來看，不同的材料、不同的培養(yǎng)基中南瓜花藥總體誘導(dǎo)率還是比較低的，這是一個(gè)普遍問題，也是現(xiàn)在國內(nèi)外眾多學(xué)者的主要研究方向[4,5]。對(duì)于本試驗(yàn)，材料是一個(gè)花培中未曾研究的新基因型，因此，對(duì)培養(yǎng)基、附加成份的反應(yīng)都是不確定因素，盡管我們也篩選了提高南瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導(dǎo)頻率的激素種類和激素組合，但其最高誘導(dǎo)率仍不到1%，因此，這方面的技術(shù)還有待于進(jìn)一步的探討。

3.2 南瓜花藥培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象普遍

花藥培養(yǎng)中的褐化問題一直以來都是相當(dāng)普遍的，一般來說，外植體材料中單寧類和多種羥酚類化合物含量高的品種易引起褐化。試驗(yàn)表明，MS培養(yǎng)基的褐變率高于MS-N培養(yǎng)基，為50.7%，這可能與培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度等有關(guān)，因此，在初培養(yǎng)階段，應(yīng)該注意選擇適宜的無機(jī)鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度。另外，正確選擇消毒劑濃度及消毒時(shí)間，也能保證較高的外植體存活率[6]。