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    可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量

    2018-10-16 07:21:14方樂(lè)霞郭宣宣朱麗麗
    關(guān)鍵詞:茚三酮中總黃精

    方樂(lè)霞,郭宣宣,張 玲,曹 富,朱麗麗

    (安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012)

    中藥黃精為滇黃精(PolygonatumKingianumColl.et Hemsl.)、黃精(P.sibiricumRed.)或多花黃精(P.cyrtonemaHua)的干燥根莖,具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之功效[1]。其中多花黃精和黃精為黃精藥材的主要來(lái)源。黃精屬于“藥食同源”的植物,不僅是常用的補(bǔ)益藥,也是一味重要的食療藥物?,F(xiàn)代研究表明,黃精含有多糖、皂苷、醌類(lèi)、微量元素和多種對(duì)人體有用的氨基酸等成分,具有延緩衰老、降低血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗抑郁、改善記憶功能和防止阿爾茨海默病等作用[2-13]。其中氨基酸是黃精補(bǔ)益強(qiáng)壯作用和增強(qiáng)免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,對(duì)維持生命活動(dòng)有著非常重要的作用[14]。目前,黃精中氨基酸含量測(cè)定方法主要為采用柱前衍生高效液相色譜法及采用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)黃精中單一氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定[15-16],尚未見(jiàn)關(guān)于黃精中總氨基酸含量測(cè)定的報(bào)道。筆者于2017年5月收集北京懷柔、安徽滁州、貴州貴陽(yáng)、福建南平等19個(gè)產(chǎn)地的黃精新鮮根莖,采用2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》“黃精”項(xiàng)下規(guī)定的加工方法加工成藥材,建立可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量,為黃精的綜合利用提供依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器 756MC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;BP211D電子天平(十萬(wàn)分之一):德國(guó)賽多利斯公司;KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;FW80高速萬(wàn)能粉碎機(jī):天津市泰斯特儀器有限公司。

    1.2 材料 L-精氨酸對(duì)照品(批號(hào)160821,純度≥98%):成都普菲德生物技術(shù)有限公司;茚三酮:天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;乙醇:上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司;磷酸等均為分析純:上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司;水為高純水。所有黃精樣品經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王德群教授鑒定為黃精(PolygonatumsibiricumRed.)或多花黃精(P.cyrtonemaHua)的干燥根莖。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取L-精氨酸對(duì)照品3.28 mg,置25 mL量瓶中,加水溶解并定容至刻度,配成濃度為0.131 2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

    2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.2 g,加入60%乙醇30 mL,超聲提取2次,每次45 min,濾過(guò),合并濾液,減壓旋至無(wú)醇味,浸膏用水溶解,定容至50 mL。

    2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取L-精氨酸對(duì)照品溶液、供試品溶液各1.0 mL,置50 mL量瓶中,加茚三酮溶液1.0 mL(稱取茚三酮1.0 g加乙醇使溶解成50 mL,冷藏備用)和磷酸鹽緩沖液(pH為6.8)1.0 mL,搖勻,水浴加熱20 min,取出,冷卻,用水定容至刻度。以相應(yīng)試劑為空白,在400~800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,對(duì)照品溶液和供試品溶液在568 nm處均有最大吸收,因此,選擇測(cè)定波長(zhǎng)為568 nm。結(jié)果見(jiàn)圖1。

    注:1.對(duì)照品;2.供試品

    2.4 顯色條件的考察

    2.4.1 緩沖鹽溶液pH值考察 精密移取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中,加入pH值分別為5.2、6.0、6.8、7.6的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL和2%茚三酮溶液1.0 mL,搖勻,水浴加熱15 min,取出,冷卻,加水定容至50 mL。以相應(yīng)試劑為空白,于568 nm處測(cè)定吸光度(absorbance, A)。結(jié)果顯示使用pH值為6.8的磷酸緩沖鹽溶液所測(cè)得的吸光度最高。因此選擇緩沖鹽溶液pH值為6.8。

    2.4.2 緩沖鹽溶液用量的考察 精密移取供試品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中,分別加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,各加入2.0%茚三酮溶液1.0 mL,搖勻,水浴加熱15 min,取出,冷卻,加水定容至50 mL,測(cè)定A值。結(jié)果顯示磷酸鹽緩沖溶液用量為1.0 mL時(shí)吸光度最高。因此選擇磷酸鹽緩沖溶液用量為1.0 mL。

    2.4.3 顯色劑用量的考察 精密移取供試品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中,加入pH值為6.8的緩沖鹽溶液1.0 mL,分別加入2.0%茚三酮溶液0.5、1.0、1.5 mL,搖勻,水浴加熱15 min,取出,冷卻,加水定容至50 mL,測(cè)定A值。結(jié)果顯示當(dāng)顯色劑用量為1.0 mL時(shí),吸光度最高。故選擇顯色劑用量為1.0 mL。

    2.4.4 顯色時(shí)間的考察 精密量取1.0 mL供試液液于量瓶中,加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL、2%茚三酮溶液1.0 mL,搖勻,于沸水浴中分別加熱5、10、15、20、25 min,取出,冷卻,加水定容至50 mL,測(cè)定A值。結(jié)果顯示加熱時(shí)間為20 min時(shí),A值最高,因此選擇顯色時(shí)間為20 min。

    2.5 提取條件的考察

    2.5.1 提取方式的考察 精密稱取樣品4份,每份約0.2 g,分別采用超聲提取、回流提取,濾過(guò),合并濾液,濃縮回收乙醇,浸膏加水溶解,定容至50 mL。精密移取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中,以“2.3”項(xiàng)下方法顯色,測(cè)定A值。結(jié)果顯示超聲提取效果優(yōu)于回流提取。

    2.5.2 提取時(shí)間的考察 精密稱取樣品3份,每份約0.2 g,采用超聲提取,超聲提取時(shí)間分別為30、45、60 min,按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起,依法操作,結(jié)果顯示提取45 min時(shí)A值最大。因此,選擇提取時(shí)間為45 min。

    2.5.3 提取次數(shù)的考察 精密稱取樣品0.2 g,加60%乙醇30 mL超聲提取,提取次數(shù)分別為1、2、3次,按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起,依法操作,結(jié)果表明提取2次和3次時(shí)A值相近,為節(jié)約時(shí)間及能源,選擇提取次數(shù)為2次。

    2.5.4 提取溶劑濃度的考察 精密稱取樣品4份,每份約0.2 g,分別加50%、55%、60%、70%乙醇30 mL,超聲提取2次,每次45 min,按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起,依法操作,結(jié)果顯示溶劑濃度為60%時(shí)A值最大。因此,選用60%的乙醇作為提取溶劑。

    2.5.5 料液比考察 精密稱取樣品5份,每份約0.2 g,分別按料液比1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250加入60%乙醇進(jìn)行超聲提取兩次,每次45 min。按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起,依法操作,結(jié)果表明料液比選取1∶150為佳。

    2.6 方法學(xué)考察

    2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取L-精氨酸對(duì)照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,分別加2%茚三酮溶液1.0 mL和磷酸鹽緩沖液1.0 mL,水浴加熱20 min,取出,冷卻,用水定容至25 mL。以相應(yīng)試劑為空白,在568 nm處測(cè)定A值,以對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),A值為縱坐標(biāo),得回歸方程為A=0.084 3c-0.154 8(r=0.997 5)。表明L-精氨酸在3.248~18.368 μg/mL濃度范圍內(nèi)與A值呈良好的線性關(guān)系。

    2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密移取供試品溶液1.0 mL,按“2.3”項(xiàng)下同法顯色,以相應(yīng)試劑為空白,于568 nm處測(cè)定A值,重復(fù)測(cè)定6次,RSD=0.14%,結(jié)果表明該方法精密度良好。

    2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材,按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密移取供試品溶液1.0 mL,按“2.3”項(xiàng)下同法顯色,測(cè)定A值,結(jié)果顯示總氨基酸含量RSD=0.20%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

    2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取供試品溶液1.0 mL,按“2.3”項(xiàng)下同法顯色,分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)測(cè)定A值,RSD=0.31%,結(jié)果表明該顯色反應(yīng)在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的黃精粉末0.1 g,平行9份,按1∶1.5、1∶1、1∶0.5分別加入精氨酸對(duì)照品,按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密移取供試品溶液1.0 mL,按“2.3”項(xiàng)下同法顯色,在568 nm測(cè)定A值,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。樣品平均加樣回收率為98.72%,RSD為1.26%,表明本法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

    表1 加樣回收率試驗(yàn)

    2.7 不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的黃精藥材,按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密移取供試品溶液1.0 mL,并按“2.3”項(xiàng)下方法顯色,在568 nm測(cè)定吸光度,樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

    3 討論

    3.1 試驗(yàn)條件討論

    3.1.1 顯色條件考察結(jié)果 分別對(duì)不同磷酸緩沖液pH值、磷酸鹽緩沖液用量、顯色劑用量、顯色時(shí)間進(jìn)行考察,最終確定黃精中總氨基酸含量測(cè)定的最佳顯色條件為:加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL,2%茚三酮溶液1.0 mL,搖勻,于沸水浴中加熱20 min。

    3.1.2 提取條件考察結(jié)果 分別考察了提取方式(超聲提取,回流提取)、不同提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溶劑濃度、料液比。確定用于黃精中總氨基酸含量測(cè)定的供試品溶液的最佳提取工藝為:取黃精粉末0.2 g,精密稱定,加入60%乙醇30 mL,超聲提取2次,每次45 min。

    表2 黃精樣品來(lái)源和總氨基酸含量

    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

    3.2.1 多花黃精中總氨基酸含量與黃精中總氨基酸含量結(jié)果分析 5個(gè)產(chǎn)地黃精總氨基酸含量范圍在5.79%~9.93%,平均值為7.83%。如以-20%為下限,建議黃精總氨基酸含量應(yīng)不低于6.26%。5個(gè)產(chǎn)地的黃精基本達(dá)到該含量。14個(gè)產(chǎn)地多花黃精總氨基酸含量范圍在2.94%~6.97%,平均值為5.10%。由于產(chǎn)地不同,各品種的多花黃精中總氨基酸含量有所差異。如以-20%為下限,建議多花黃精總氨基酸含量應(yīng)不低于4.08%。含量結(jié)果顯示黃精中總氨基酸含量明顯高于多花黃精。

    3.2.2 不同產(chǎn)地多花黃精中總氨基酸含量比較 14個(gè)產(chǎn)地多花黃精總氨基酸含量在其分布的東、西、北緣較高;從四川盆地到浙、閩丘陵到貴州、湖南山區(qū),總氨基酸含量呈增大趨勢(shì)。貴州遵義、江西撫州、福建南平、湖南岳陽(yáng)多花黃精總氨基酸含量較高,因其經(jīng)度相似,均屬于亞熱帶溫潤(rùn)季風(fēng)區(qū),降水豐富,利于氨基酸成分的積累。金寨(葉背面有毛型)、金寨(葉梗長(zhǎng)型)、浙江杭州、四川資陽(yáng)含量較低。安徽青陽(yáng)多花黃精總氨基酸含量明顯高于安徽金寨,因青陽(yáng)既有亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候的總體特征,又有受山區(qū)海拔高度、地形地勢(shì)影響而形成的陰、涼、濕的山區(qū)氣候特點(diǎn)。四川資陽(yáng)多花黃精總氨基酸含量最低,可能是由于其處于盆地,常年有霧,日照不足,不利于氨基酸成分的積累。

    3.2.3 不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量比較 黃精產(chǎn)地分布與總氨基酸含量呈現(xiàn)出由西向東逐漸下降的趨勢(shì)。陜西商洛由于受到冬夏季風(fēng)和青藏高原環(huán)流的影響,加之秦嶺整個(gè)山脈對(duì)南方暖濕氣流的阻擋作用,造成其四季分明,雨熱同期的氣候特點(diǎn),這可能是造成商洛黃精中氨基酸含量較高的原因。

    本研究采用可見(jiàn)分光光度法建立了黃精中總氨基酸含量的測(cè)定方法,該方法操作簡(jiǎn)便、快速,結(jié)果準(zhǔn)確,可作為黃精中總氨基酸含量的測(cè)定方法。本研究對(duì)黃精中總氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定,對(duì)于黃精的綜合利用具有一定的意義。

    (在樣品的收集過(guò)程中得到安徽森灃綜合開(kāi)發(fā)有限公司的幫助,樣品的加工得到安徽中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)研究生彭星星、劉校的幫助,在此表示感謝!)

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