可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量

方樂(lè)霞，郭宣宣，張 玲，曹 富，朱麗麗

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

中藥黃精為滇黃精(PolygonatumKingianumColl.et Hemsl.)、黃精(P.sibiricumRed.)或多花黃精(P.cyrtonemaHua)的干燥根莖，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之功效[1]。其中多花黃精和黃精為黃精藥材的主要來(lái)源。黃精屬于“藥食同源”的植物，不僅是常用的補(bǔ)益藥，也是一味重要的食療藥物?，F(xiàn)代研究表明，黃精含有多糖、皂苷、醌類(lèi)、微量元素和多種對(duì)人體有用的氨基酸等成分，具有延緩衰老、降低血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗抑郁、改善記憶功能和防止阿爾茨海默病等作用[2-13]。其中氨基酸是黃精補(bǔ)益強(qiáng)壯作用和增強(qiáng)免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，對(duì)維持生命活動(dòng)有著非常重要的作用[14]。目前，黃精中氨基酸含量測(cè)定方法主要為采用柱前衍生高效液相色譜法及采用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)黃精中單一氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定[15-16]，尚未見(jiàn)關(guān)于黃精中總氨基酸含量測(cè)定的報(bào)道。筆者于2017年5月收集北京懷柔、安徽滁州、貴州貴陽(yáng)、福建南平等19個(gè)產(chǎn)地的黃精新鮮根莖，采用2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》“黃精”項(xiàng)下規(guī)定的加工方法加工成藥材，建立可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量，為黃精的綜合利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 756MC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BP211D電子天平(十萬(wàn)分之一)：德國(guó)賽多利斯公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FW80高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 材料 L-精氨酸對(duì)照品(批號(hào)160821，純度≥98%)：成都普菲德生物技術(shù)有限公司；茚三酮：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；乙醇：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；磷酸等均為分析純：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；水為高純水。所有黃精樣品經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王德群教授鑒定為黃精(PolygonatumsibiricumRed.)或多花黃精(P.cyrtonemaHua)的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取L-精氨酸對(duì)照品3.28 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配成濃度為0.131 2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.2 g，加入60%乙醇30 mL，超聲提取2次，每次45 min，濾過(guò)，合并濾液，減壓旋至無(wú)醇味，浸膏用水溶解，定容至50 mL。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取L-精氨酸對(duì)照品溶液、供試品溶液各1.0 mL，置50 mL量瓶中，加茚三酮溶液1.0 mL(稱取茚三酮1.0 g加乙醇使溶解成50 mL，冷藏備用)和磷酸鹽緩沖液(pH為6.8)1.0 mL，搖勻，水浴加熱20 min，取出，冷卻，用水定容至刻度。以相應(yīng)試劑為空白，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，對(duì)照品溶液和供試品溶液在568 nm處均有最大吸收，因此，選擇測(cè)定波長(zhǎng)為568 nm。結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：1.對(duì)照品；2.供試品

2.4 顯色條件的考察

2.4.1 緩沖鹽溶液pH值考察 精密移取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中，加入pH值分別為5.2、6.0、6.8、7.6的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL和2%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，水浴加熱15 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL。以相應(yīng)試劑為空白，于568 nm處測(cè)定吸光度(absorbance, A)。結(jié)果顯示使用pH值為6.8的磷酸緩沖鹽溶液所測(cè)得的吸光度最高。因此選擇緩沖鹽溶液pH值為6.8。

2.4.2 緩沖鹽溶液用量的考察 精密移取供試品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中，分別加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，各加入2.0%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，水浴加熱15 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL，測(cè)定A值。結(jié)果顯示磷酸鹽緩沖溶液用量為1.0 mL時(shí)吸光度最高。因此選擇磷酸鹽緩沖溶液用量為1.0 mL。

2.4.3 顯色劑用量的考察 精密移取供試品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中，加入pH值為6.8的緩沖鹽溶液1.0 mL，分別加入2.0%茚三酮溶液0.5、1.0、1.5 mL，搖勻，水浴加熱15 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL，測(cè)定A值。結(jié)果顯示當(dāng)顯色劑用量為1.0 mL時(shí)，吸光度最高。故選擇顯色劑用量為1.0 mL。

2.4.4 顯色時(shí)間的考察 精密量取1.0 mL供試液液于量瓶中，加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL、2%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，于沸水浴中分別加熱5、10、15、20、25 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL，測(cè)定A值。結(jié)果顯示加熱時(shí)間為20 min時(shí)，A值最高，因此選擇顯色時(shí)間為20 min。

2.5 提取條件的考察

2.5.1 提取方式的考察 精密稱取樣品4份，每份約0.2 g，分別采用超聲提取、回流提取，濾過(guò)，合并濾液，濃縮回收乙醇，浸膏加水溶解，定容至50 mL。精密移取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中，以“2.3”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定A值。結(jié)果顯示超聲提取效果優(yōu)于回流提取。

2.5.2 提取時(shí)間的考察 精密稱取樣品3份，每份約0.2 g，采用超聲提取，超聲提取時(shí)間分別為30、45、60 min，按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起，依法操作，結(jié)果顯示提取45 min時(shí)A值最大。因此，選擇提取時(shí)間為45 min。

2.5.3 提取次數(shù)的考察 精密稱取樣品0.2 g，加60%乙醇30 mL超聲提取，提取次數(shù)分別為1、2、3次，按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起，依法操作，結(jié)果表明提取2次和3次時(shí)A值相近，為節(jié)約時(shí)間及能源，選擇提取次數(shù)為2次。

2.5.4 提取溶劑濃度的考察 精密稱取樣品4份，每份約0.2 g，分別加50%、55%、60%、70%乙醇30 mL，超聲提取2次，每次45 min，按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起，依法操作，結(jié)果顯示溶劑濃度為60%時(shí)A值最大。因此，選用60%的乙醇作為提取溶劑。

2.5.5 料液比考察 精密稱取樣品5份，每份約0.2 g，分別按料液比1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250加入60%乙醇進(jìn)行超聲提取兩次，每次45 min。按“2.5.1”項(xiàng)下自“濾過(guò)”起，依法操作，結(jié)果表明料液比選取1∶150為佳。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取L-精氨酸對(duì)照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別加2%茚三酮溶液1.0 mL和磷酸鹽緩沖液1.0 mL，水浴加熱20 min，取出，冷卻，用水定容至25 mL。以相應(yīng)試劑為空白，在568 nm處測(cè)定A值，以對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，得回歸方程為A=0.084 3c-0.154 8(r=0.997 5)。表明L-精氨酸在3.248～18.368 μg/mL濃度范圍內(nèi)與A值呈良好的線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下同法顯色，以相應(yīng)試劑為空白，于568 nm處測(cè)定A值，重復(fù)測(cè)定6次，RSD=0.14%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下同法顯色，測(cè)定A值，結(jié)果顯示總氨基酸含量RSD=0.20%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下同法顯色，分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)測(cè)定A值，RSD=0.31%，結(jié)果表明該顯色反應(yīng)在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的黃精粉末0.1 g，平行9份，按1∶1.5、1∶1、1∶0.5分別加入精氨酸對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下同法顯色，在568 nm測(cè)定A值，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。樣品平均加樣回收率為98.72%，RSD為1.26%，表明本法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.7 不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的黃精藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1.0 mL，并按“2.3”項(xiàng)下方法顯色，在568 nm測(cè)定吸光度，樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 試驗(yàn)條件討論

3.1.1 顯色條件考察結(jié)果 分別對(duì)不同磷酸緩沖液pH值、磷酸鹽緩沖液用量、顯色劑用量、顯色時(shí)間進(jìn)行考察，最終確定黃精中總氨基酸含量測(cè)定的最佳顯色條件為：加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，于沸水浴中加熱20 min。

3.1.2 提取條件考察結(jié)果 分別考察了提取方式(超聲提取，回流提取)、不同提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溶劑濃度、料液比。確定用于黃精中總氨基酸含量測(cè)定的供試品溶液的最佳提取工藝為：取黃精粉末0.2 g，精密稱定，加入60%乙醇30 mL，超聲提取2次，每次45 min。

表2 黃精樣品來(lái)源和總氨基酸含量

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

3.2.1 多花黃精中總氨基酸含量與黃精中總氨基酸含量結(jié)果分析 5個(gè)產(chǎn)地黃精總氨基酸含量范圍在5.79%～9.93%，平均值為7.83%。如以-20%為下限，建議黃精總氨基酸含量應(yīng)不低于6.26%。5個(gè)產(chǎn)地的黃精基本達(dá)到該含量。14個(gè)產(chǎn)地多花黃精總氨基酸含量范圍在2.94%～6.97%，平均值為5.10%。由于產(chǎn)地不同，各品種的多花黃精中總氨基酸含量有所差異。如以-20%為下限，建議多花黃精總氨基酸含量應(yīng)不低于4.08%。含量結(jié)果顯示黃精中總氨基酸含量明顯高于多花黃精。

3.2.2 不同產(chǎn)地多花黃精中總氨基酸含量比較 14個(gè)產(chǎn)地多花黃精總氨基酸含量在其分布的東、西、北緣較高；從四川盆地到浙、閩丘陵到貴州、湖南山區(qū)，總氨基酸含量呈增大趨勢(shì)。貴州遵義、江西撫州、福建南平、湖南岳陽(yáng)多花黃精總氨基酸含量較高，因其經(jīng)度相似，均屬于亞熱帶溫潤(rùn)季風(fēng)區(qū)，降水豐富，利于氨基酸成分的積累。金寨(葉背面有毛型)、金寨(葉梗長(zhǎng)型)、浙江杭州、四川資陽(yáng)含量較低。安徽青陽(yáng)多花黃精總氨基酸含量明顯高于安徽金寨，因青陽(yáng)既有亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候的總體特征，又有受山區(qū)海拔高度、地形地勢(shì)影響而形成的陰、涼、濕的山區(qū)氣候特點(diǎn)。四川資陽(yáng)多花黃精總氨基酸含量最低，可能是由于其處于盆地，常年有霧，日照不足，不利于氨基酸成分的積累。

3.2.3 不同產(chǎn)地黃精中總氨基酸含量比較 黃精產(chǎn)地分布與總氨基酸含量呈現(xiàn)出由西向東逐漸下降的趨勢(shì)。陜西商洛由于受到冬夏季風(fēng)和青藏高原環(huán)流的影響，加之秦嶺整個(gè)山脈對(duì)南方暖濕氣流的阻擋作用，造成其四季分明，雨熱同期的氣候特點(diǎn)，這可能是造成商洛黃精中氨基酸含量較高的原因。

本研究采用可見(jiàn)分光光度法建立了黃精中總氨基酸含量的測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為黃精中總氨基酸含量的測(cè)定方法。本研究對(duì)黃精中總氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于黃精的綜合利用具有一定的意義。

(在樣品的收集過(guò)程中得到安徽森灃綜合開(kāi)發(fā)有限公司的幫助，樣品的加工得到安徽中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)研究生彭星星、劉校的幫助，在此表示感謝！)