白竭散對肛瘺術(shù)后創(chuàng)面血管生成的調(diào)控機制研究

方笑麗，鄧 恒，王建民

(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肛腸三科，安徽 合肥 230031)

肛瘺又稱肛管直腸瘺，是肛管直腸周圍間隙化膿性感染破潰形成的瘺，是一種常見的肛門直腸疾病。肛瘺發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病多為青年人群，發(fā)病率約為5%[1]。至今手術(shù)仍是肛瘺最有效的治療手段，然而由于肛門特殊的生理功能和解剖結(jié)構(gòu)，術(shù)后創(chuàng)面愈合往往較慢，且易發(fā)生感染、瘢痕增生等，使病情遷延[2]。因此，肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合是近年來醫(yī)學研究的熱點。創(chuàng)面修復過程復雜，與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecules, PECAM-1/CD31)及第Ⅷ因子關(guān)聯(lián)抗原(von willebrand factor, VWF)表達水平密切相關(guān)[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，白竭散可通過增加肛瘺術(shù)后創(chuàng)面羥脯氨酸含量促進創(chuàng)面愈合[4]，但對創(chuàng)面血管生成的影響尚未闡明。因此，本研究通過白竭散對肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的干預，觀察其對VEGF、CD31、VWF蛋白表達的影響。

1 臨床資料

1.1 診斷標準 符合《中醫(yī)病證診斷療效標準》[5]肛瘺診斷標準。

1.2 納入標準 符合診斷標準，且自愿接受本治療并簽署知情同意書。

1.3 排除標準 排除合并肝病、腎病、代謝性疾病、嚴重的神經(jīng)缺損等嚴重疾病者，妊娠期、哺乳期或正準備妊娠的婦女，對多種藥物過敏等過敏體質(zhì)者，未滿觀察期而中斷治療、無法判斷療效或資料不全者，以及其他難以對其有效性和安全性做出確切評價者。

1.4 一般資料 選取2014年11月至2016年5月就診于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的75例肛瘺患者，將其隨機分為白竭散組、貝復濟組、對照組，每組25例。其中白竭散組男14例，女11例，平均年齡(40.47±8.45)歲；貝復濟組男15例，女10例，平均年齡(38.92±10.25)歲；對照組男13例，女12例，平均年齡(39.85±9.19)歲。3組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 方法

2.1 治療方法 3組患者均行術(shù)前備皮、術(shù)晨清潔灌腸，全部病例均采用腰椎麻醉，采用肛瘺切除術(shù)，切口均不縫合，檢査創(chuàng)面無活動性出血后，用凡士林油紗條填塞，塔形紗布壓迫，大敷貼固定。術(shù)后酌情運用抗生素，保持大便通暢，每日便后用痔瘺洗劑坐浴，術(shù)后第2天開始每日便后用痔瘺洗劑坐浴、換藥，直至創(chuàng)面愈合。

白竭散組：每日便后坐浴，患者取側(cè)臥位，生理鹽水棉球清洗創(chuàng)面，拭干后每平方厘米用2 g白竭散均勻撒于4 cm×2 cm大小的凡士林紗條上，填塞切口，無菌敷料外敷，膠布固定，直至痊愈。

貝復濟組：同法清理創(chuàng)面，每平方厘米用貝復濟150 Au噴涂于創(chuàng)面，然后用浸有貝復濟的紗條填塞切口，無菌敷料外敷，膠布固定，直至痊愈。

對照組：同法清理創(chuàng)面，用4 cm ×2 cm 大小的凡士林填塞切口，無菌敷料外敷，膠布固定，直至痊愈。換藥時注意切口引流情況及創(chuàng)面情況。

2.2 指標觀察

2.2.1 毛細血管計數(shù) 術(shù)后7、14 d，分別觀察創(chuàng)面新鮮肉芽組織，10%甲醛固定48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，作4 μm連續(xù)切片，將石蠟切片按常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色5 min，自來水沖洗至無色；1%鹽酸乙醇分化，去除過度染色部分，伊紅染色2 min，蒸餾水清洗3次；常規(guī)梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，自然晾干后，進行光鏡觀察。

2.2.2 免疫組織化學法觀察VEGF、CD31及VWF表達水平 分別取術(shù)后7、14 d創(chuàng)面新鮮肉芽組織，10%甲醛固定48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，作4 μm連續(xù)切片，將石蠟切片按常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復，阻斷內(nèi)生過氧化物酶后，滴加一抗工作液，4 ℃過夜，復溫0.5～1 h，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。滴加兔二步法二抗工作液，37 ℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色液顯色，蘇木精復染3 min，1%鹽酸乙醇脫色20 s，PBS返藍，二甲苯透明，最后樹膠封固。

2.2.3 Western blot法檢測VEGF、CD31、VWF蛋白表達水平 分別取術(shù)后7、14 d創(chuàng)面新鮮肉芽組織，剪碎，RIPA組織裂解液裂解，吸取勻漿后，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，提取總蛋白。用BCA法測蛋白濃度。取蛋白20 μg作電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至尼龍濾膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉4 h，TBST洗3次，每次10 min，分別加入抗VEGF、CD31、VWF多克隆抗體，4 ℃過夜。分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，脫色搖床搖1.5 h，TBST洗3 次，每次10 min。以β-actin作為內(nèi)參。凝膠成像系統(tǒng)拍照，并掃描分析各條帶的光密度，以β-actin的表達量為對照計算各組VEGF、CD31、VWF的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 3組創(chuàng)面毛細血管數(shù)比較 術(shù)后7、14 d，貝復濟組和白竭散組創(chuàng)面毛細血管數(shù)均較對照組明顯增加(P<0.05)，白竭散組創(chuàng)面毛細血管數(shù)明顯多于貝復濟組(P<0.05)；術(shù)后14 d，3組創(chuàng)面毛細血管數(shù)較術(shù)后7 d明顯增加(P<0.05)。結(jié)果提示白竭散可促進肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面毛細血管新生，效果優(yōu)于貝復濟。見表1和圖1。

表1 3組創(chuàng)面毛細血管數(shù)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05；與術(shù)后7 d比較，△P<0.05

圖1 3組創(chuàng)面毛細血管數(shù)(蘇木精-伊紅染色，10×20倍)

3.2 3組患者創(chuàng)面VEGF表達水平比較 免疫組織化學法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，貝復濟組和白竭散組的VEGF在胞漿內(nèi)呈大量棕黃色顆粒，數(shù)量明顯增多。Western blot法檢測結(jié)果顯示，術(shù)后7、14 d，貝復濟組、白竭散組較對照組創(chuàng)面VEGF表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術(shù)后14 d，白竭散組VEGF表達水平明顯高于貝復濟組(P<0.05)。見圖2、圖3。

3.3 3組患者創(chuàng)面CD31表達水平比較 免疫組織化學法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，貝復濟組和白竭散組的CD31在胞漿內(nèi)呈大量棕褐色顆粒，數(shù)量明顯增多。Western blot法檢測結(jié)果顯示，術(shù)后7、14 d，與對照組比較，貝復濟組、白竭散組創(chuàng)面CD31表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；白竭散組較貝復濟組CD31表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、圖5。

圖2 3組術(shù)后7、14 d創(chuàng)面VEGF表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05

圖4 3組術(shù)后7、14 d創(chuàng)面CD31表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05

3.4 3組患者創(chuàng)面VWF表達水平比較 免疫組織化學法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，貝復濟組和白竭散組的VWF在胞漿內(nèi)呈大量棕褐色顆粒，數(shù)量明顯增多。術(shù)后7、14 d，貝復濟組、白竭散組創(chuàng)面VWF表達水平較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與貝復濟組比較，白竭散組創(chuàng)面VWF表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6、圖7。

圖6 3組術(shù)后7、14 d創(chuàng)面VWF表達水平

4 討論

肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的過程是內(nèi)皮細胞、成纖維細胞增殖分化，纖維蛋白合成、重組，新生血管的形成以及表皮細胞增生覆蓋創(chuàng)面的過程。影響肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的因素主要有營養(yǎng)狀況、基礎疾病、生活習慣、局部感染、缺血、創(chuàng)面異物等[6]。創(chuàng)面愈合過程中血管內(nèi)皮細胞經(jīng)過生芽、遷移、增殖、基質(zhì)重塑等過程，逐漸形成新毛細血管。血管新生對創(chuàng)面愈合起著至關(guān)重要的作用。創(chuàng)面毛細血管數(shù)目多、血運豐富，可有效提高創(chuàng)面部分新陳代謝的速度，同時還可降低毛細血管的脆弱性，提高組織氧供，促進傷口愈合[7]。血管內(nèi)皮細胞的激活是血管新生的首要步驟。術(shù)后創(chuàng)面可刺激各種細胞因子，活化血管內(nèi)皮細胞，刺激VEGF、CD31、VWF等表達增加，激活創(chuàng)面修復。

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05

白及為蘭科多年生草本植物白及的干燥塊莖，具有收斂止血、消腫生肌的功效，可用于外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等。彭銳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，白及通過促進創(chuàng)面肉芽組織、毛細血管生長及創(chuàng)面組織VEGF生成，促進創(chuàng)面愈合。白及同時具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，誘導免疫調(diào)節(jié)因子的表達，加強對細菌、異物的吞噬作用，促進釋放各種生長因子，以利于創(chuàng)面愈合[9-10]。

龍血竭是劍葉龍血樹樹干產(chǎn)生的紅色樹脂，具有活血化瘀、消腫止痛、止血補血、斂瘡生肌之效。李曉蘭等[11]研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭可明顯縮短肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合時間,且無瘢痕過度生長。李丹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血竭乙酸乙酯提取物可促進成纖維細胞增殖，減少Ⅲ型前膠原表達，從而促進創(chuàng)面愈合，又不致于過度增生而形成病理性瘢痕。朱頡等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血竭殼聚糖藥膜可通過活化Wnt/β-catenin信號通路，促進創(chuàng)面β-catenin、VEGF、Cyclin D1蛋白及其mRNA的表達，從而促進創(chuàng)面愈合。

白竭散由白及和血竭配伍組方，前期研究發(fā)現(xiàn)，白竭散可通過提高創(chuàng)面羥脯氨酸含量促進肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面愈合[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復的過程中，白竭散組創(chuàng)面局部毛細血管數(shù)量顯著高于貝復濟組和對照組。VEGF作為一種高度特異的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，可以通過與內(nèi)皮細胞上的受體與內(nèi)皮細胞高親和力結(jié)合，一方面直接刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，誘導其遷移和形成管腔樣結(jié)構(gòu)；另一方面增加微血管通透性，引起血漿蛋白(主要是纖維蛋白原)外滲，并通過誘導間質(zhì)產(chǎn)生而促進體內(nèi)新生血管生成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后7、14 d白竭散組創(chuàng)面VEGF蛋白表達水平較對照組及貝復濟組顯著增加，白竭散在創(chuàng)面愈合過程中能夠更有效促進創(chuàng)面VEGF的表達，從而促進創(chuàng)面新生血管的生長，加速肉芽生長，促進創(chuàng)面愈合。CD31是內(nèi)皮細胞上介導細胞間黏附的整合素蛋白，作為一種新型的微血管標記物，對新生血管內(nèi)皮細胞的標記的特異性很強，并參與血管新生過程，在顯示血管內(nèi)皮細胞時的特異性優(yōu)于其他的內(nèi)皮細胞標記物[15]。VWF是血管內(nèi)皮細胞特異性標志之一。血中VWF主要由內(nèi)皮細胞合成，也可來源于巨核細胞和血小板，血管內(nèi)皮細胞和血管受損時，細胞內(nèi)VWF含量明顯降低而血中含量增加，并與血小板協(xié)同對血管損傷起修補作用[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，VWF可激活整合素ανβ3促進血管新生[17]。本研究顯示，白竭散組術(shù)后7、14 d創(chuàng)面CD31、VWF蛋白表達水平較貝復濟組和對照組顯著增加，表明白竭散可顯著加速創(chuàng)面新生血管生成，改善局部微循環(huán)，增加局部血流，有效地加快創(chuàng)面的愈合速度，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

本研究表明，白竭散在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復過程中對血管生成的促進作用優(yōu)于貝復濟，白竭散主要通過促進創(chuàng)面肉芽組織中VEGF、CD31、VWF蛋白表達，增加創(chuàng)面新生毛細血管的生成，改善術(shù)后創(chuàng)面局部缺血、缺氧狀態(tài)，促進創(chuàng)面愈合。