LC-MS/MS法測定比格犬血漿中米非司酮的方法學(xué)建立

郭永，賈重陽，許保海，3，涂鵬程，4，裴開顏*

(1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.蘭州市第二人民醫(yī)院，蘭州 730046；3.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遵義 563003；4.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730)

米非司酮是1981年由法國Roussel-Uclaf公司首家生產(chǎn)的19-去甲睪酮衍生物，是一種受體水平的甾體類激素拮抗劑，與孕激素受體的結(jié)合力較黃體酮強(qiáng)6～8倍。自米非司酮作為終止早孕的藥物用于臨床以來，經(jīng)過20多年的摸索實踐，米非司酮在臨床上得到廣泛運(yùn)用，主要應(yīng)用于終止早孕、緊急避孕、藥物流產(chǎn)[1]和治療子宮肌瘤[2-3]、子宮內(nèi)膜異位癥[4-5]、庫欣綜合征[6]、胰島素抵抗[7]、乳腺癌[8]、子宮內(nèi)膜癌[9]以及皮膚老化[10]等。米非司酮口服后吸收良好，但因存在肝臟首過效應(yīng)，部分藥物被代謝而致生物利用度降低，故欲對其低劑量藥代動力學(xué)特征進(jìn)行研究，則需要建立高效靈敏的分析方法。目前文獻(xiàn)報道的米非司酮檢測方法，多為高效液相色譜(HPLC)法[11-13]和放射免疫分析法(RIA)[14]等。隨著分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)應(yīng)用于臨床化學(xué)的檢測領(lǐng)域，由于LC-MS/MS法分析速度快、靈敏度高，近年來被認(rèn)為是痕量定量分析的金標(biāo)準(zhǔn)。本文旨在建立一種簡單快捷、靈敏度高的LC-MS/MS法測定比格犬血漿中米非司酮的濃度，為進(jìn)行口服低劑量(25 mg)米非司酮片的人體藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、動物及材料

1.實驗動物：比格犬，雌性，普通級，8～12 kg，購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0001。試驗動物檢疫觀察14 d，觀察動物的外觀體征、行為活動、糞便性狀、體重及飲食等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)有病動物及時剔除。動物使用前經(jīng)動物管理人員和專題負(fù)責(zé)人檢查認(rèn)可。

動物房環(huán)境條件控制室溫18℃～24℃，相對濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。籠具、食盒、飲水瓶每天沖洗一次，動物房地面和墻面每周消毒一次，用0.1%新潔爾滅或0.5%的84消毒液擦拭消毒，兩種消毒液交叉使用。普通飼料為犬維持料，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飲水：飲用純化水，經(jīng)酸化后自由飲用。

2.儀器：API 4000 Qtrap液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(AppliedBioSystem，美國)，包括：API 4000 Qtrap三重四極桿質(zhì)譜、配有ESI源、Analyst 1.5.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；液相部分為Agilent1200高效液相色譜，配有G1312A二元溶劑輸送泵、G1367A自動進(jìn)樣器、G1379A脫氣機(jī)、G1316A柱溫箱。十萬分之一分析天平DENVER Instrument TB-25(max 21 g，d=0.01 mg)；美國Labnet VX-100渦旋振蕩器(VORTEX)；低溫高速離心機(jī)5810R(Eppendorf，德國)；4℃、-20℃、-80℃ 冰箱(青島海爾)。

3.試劑：米非司酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度>99%，批號72801608006(秦皇島紫竹藥業(yè))；內(nèi)標(biāo)物特非那定(Sigma，美國)；甲醇(批號170237)、甲酸(批號174477)、乙腈(批號168772)、DMSO(批號155977)、甲基叔丁基醚(MTBE，批號166804)均為色譜純(Fisher Scientific，美國)。

4.對照品溶液的制備：(1)首先配置標(biāo)準(zhǔn)品母液，用DMSO配制1 mg/ml的米非司酮溶液備用。(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：由1 mg/ml的米非司酮母液用甲醇依次稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(10、20、50、200、500、2 000、5 000、10 000 ng/ml)的溶液。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)為：1、2、5、20、50、200、500、1 000 ng/ml。

5.內(nèi)標(biāo)溶液制備：用甲醇/乙腈(1/1，v/v)溶液將特非那定母液稀釋成濃度為50 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液備用。

6.質(zhì)控(QC)標(biāo)準(zhǔn)溶液：最低定量下限(LLOQ)、低、中、高四標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為：10、20、500、8 000 ng/ml，LLOQ、低、中、高四濃度點(diǎn)分別為：1、2、50、800 ng/ml。

7.試劑的保存：4℃保存。

二、方法

1.給藥及血漿樣本采集：(1)靜脈給藥：比格犬，3只，雌性，靜脈注射米非司酮1 mg/kg。給藥前及給藥后5、15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本。(2)單次灌胃給藥：比格犬，雌性，每給藥劑量3只，分別給予米非司酮灌胃1、3、10 mg/kg。給藥前及給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本。(3)多次灌胃給藥：比格犬，3只，雌性，分別給予米非司酮灌胃3 mg/kg，給藥間隔4 d或7 d，連續(xù)給藥7次。首次和末次給藥前，給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h以及第7、14、21、28、35、42 d采集血漿標(biāo)本。

對照組血漿樣本采自非靜脈及灌胃給藥的比格犬。標(biāo)本采集后EDTA抗凝，24 h以內(nèi)的血漿保存于-4C冰箱，24 h以后凍存于-80C冰箱。

2.色譜條件：色譜柱：Kinetex-C18 110 A column(3 mm×30 mm ID，2.6 μm，phenomenex)；流動相：A相，甲醇(含0.1%甲酸)；B相，水(0.1%甲酸)；流速：0.8 ml/min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

3.質(zhì)譜條件：以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)監(jiān)測離子對(米非司酮：430.2→372.3；內(nèi)標(biāo)特非那定：472.2→436.2)的離子流。離子噴霧電壓5 500 V；離子源溫度為550℃；離子源Gas1 60 psi；離子源Gas2 60 psi；氣簾氣12 psi。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取空白血漿50 μl，加入10 μl 50 ng/ml的特非那定內(nèi)標(biāo)溶液，再加入5 μl標(biāo)準(zhǔn)溶液，500 μl的甲基叔丁基醚(MTBE)，充分渦旋3 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清400 μl，氮?dú)獯蹈珊?，?50 μl的甲醇/水(1∶1)復(fù)溶，充分渦旋1 min后直接進(jìn)樣。

5.QC樣品的制備：取空白血漿50 μl，加入10 μl 50 ng/ml的特非那定內(nèi)標(biāo)溶液，再加入5 μl標(biāo)準(zhǔn)溶液，500 μl的MTBE，充分渦旋3 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清400 μl，氮?dú)獯蹈珊?，?50 μl的甲醇/水(1∶1)復(fù)溶，充分渦旋1 min后直接進(jìn)樣。

6.回收率樣品的制備：取空白血漿50 μl，加入10 μl甲醇/乙腈(1/1，v/v)，再加入5 μl 甲醇溶液，500 μl的MTBE，充分渦旋3 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清400 μl，氮?dú)獯蹈珊?，加? μl標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入8 μl 50 ng/ml的特非那定內(nèi)標(biāo)溶液，再加入138 μl的甲醇/水(1∶1)，充分渦旋1 min后直接進(jìn)樣分析。

7.基質(zhì)效應(yīng)樣品的制備：取50 μl水，加入10 μl甲醇/乙腈(1/1，v/v)，再加入5 μl甲醇溶液，500 μl的MTBE，充分渦旋3 min后，4 000 r/min 離心10 min，取上清400 μl，氮?dú)獯蹈珊?，加? μl標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入8 μl 50 ng/ml的特非那定內(nèi)標(biāo)溶液，再加入138 μl的甲醇/水(1∶1)，充分渦旋1 min后直接進(jìn)樣分析。

8.專屬性檢測：取6份不同來源比格犬空白血漿。將實驗比格犬空白血漿分析色譜圖與加藥后比格犬血漿色譜圖進(jìn)行比較，觀察比格犬血漿液液萃取后有無內(nèi)源性干擾物質(zhì)，對待測物和內(nèi)標(biāo)物峰形有無明顯干擾。

9.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍：血漿中藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)為1、2、5、20、50、200、500和1 000 ng/ml。以米非司酮的濃度X(ng/ml)為橫坐標(biāo)，以米非司酮的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(W=1/X2)進(jìn)行回歸計算，所得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)。

10.精密度(RSD)與準(zhǔn)確度(RE)：選擇LLOQ、低、中、高4個濃度點(diǎn)(1、2、50和800 ng/ml)，平行樣6份，作為日內(nèi)RSD。連續(xù)檢測3 d，作為日間RSD。隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算QC樣品的濃度，采用單因素方差分析法計算RSD和RE。

11.穩(wěn)定性檢測：本實驗通過比較樣品在5種存放條件下的準(zhǔn)確度，檢測樣品在分析前、中、后期的穩(wěn)定性。(1)血漿樣品室溫放置5 h，低、高兩個濃度點(diǎn)平行樣6份；(2)血漿樣品3次冷凍、解凍循環(huán)穩(wěn)定性，低、高兩個濃度點(diǎn)平行樣6份；(3)血漿樣品-80℃長期穩(wěn)定性40 d，低、高兩個濃度點(diǎn)平行樣6份；(4)血漿樣品處理后4℃放置24 h穩(wěn)定性，低、高兩個濃度點(diǎn)平行樣6份；(5)米非司酮和內(nèi)標(biāo)儲備液4℃ 40 d儲存穩(wěn)定性，兩個不同日期溶液平行樣6份。

12.提取回收率：低、中、高三濃度點(diǎn)(2、50和800 ng/ml)平行樣6份，通過QC樣品平均峰面積比相應(yīng)濃度的回收率樣品的峰面積，計算每個濃度樣品和內(nèi)標(biāo)的回收率。

13.基質(zhì)效應(yīng)：低、中、高三濃度點(diǎn)(2、50和800 ng/ml)平行樣6份，采集峰面積C，通過公式B/A×100%計算基質(zhì)效應(yīng)。

14.血漿樣品稀釋可靠性：配置濃度為4 000 ng/ml血漿樣品，將其稀釋5倍，平行樣6份。

結(jié) 果

一、方法專屬性

將實驗比格犬空白血漿分析色譜圖(圖1)與加藥后比格犬血漿色譜圖(圖2)進(jìn)行比較，分析結(jié)果顯示比格犬血漿液液萃取后無內(nèi)源性干擾物質(zhì)，對待

A：米非司酮；B：內(nèi)標(biāo)圖1 比格犬空白血漿色譜圖

A：米非司酮；B：內(nèi)標(biāo)圖2 加藥后比格犬血漿色譜圖

測物和內(nèi)標(biāo)物峰形無明顯干擾。該LC-MS/MS方法的專屬性較好，米非司酮保留時間為2.11 min，特非那定保留時間為2.22 min(圖2)。

二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

通過配制的不同濃度樣品進(jìn)樣分析，記錄色譜圖(圖3、4)，通過直線回歸計算，得出直線回歸方程，

A：米非司酮；B：內(nèi)標(biāo)圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線1 ng/ml色譜圖

A：米非司酮；B：內(nèi)標(biāo)圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線1 000 ng/ml色譜圖

即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)4次均>0.99，說明米非司酮在1～1 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法靈敏度方面，LLOQ為1 ng/ml，信噪比(S/N)>10。LLOQ RSD為10.4%，RE為99.6%(表2，圖5)。

三、RSD與RE

實驗結(jié)果如表3所示，QC樣品的日內(nèi)RSD≤11.6%，日間RSD≤9.9%，日內(nèi)RE≤11.1%，日間RE≤7.8%。結(jié)果顯示，該方法符合FDA生物樣品分析方法指南的要求，重復(fù)性較好，可用于檢測比格犬血漿中的米非司酮。

四、穩(wěn)定性

本實驗通過比較樣品在5種存放條件下的準(zhǔn)確度，檢測了樣品在分析前、中、后期的穩(wěn)定性。存放條件包括：室溫放置5 h、4℃放置24 h、-80℃反復(fù)凍融3次、-80℃長期穩(wěn)定性40 d以及米非司酮和內(nèi)標(biāo)儲備液4℃ 40 d儲存穩(wěn)定性。實驗結(jié)果顯示，儲備液室溫放置5 h穩(wěn)定(RE：-5.42%～-4.19%)，4℃放置24 h穩(wěn)定(RE：-3.75%～-2.72%)，-80℃反復(fù)凍融3次穩(wěn)定(RE：-5.42%～-7.10%)，長期穩(wěn)定(RE：-0.42%～0.48%)，以及米非司酮和內(nèi)標(biāo)儲備液4℃ 40 d儲存穩(wěn)定(表4)。實驗結(jié)果顯示，待測物基本沒有被降解，在整個實驗過程中基本穩(wěn)定。

表2 LLOQ數(shù)據(jù)表

A：米非司酮；B：內(nèi)標(biāo)圖5 LLOQ色譜圖

批 次濃度(ng/ml)加入量測得量RSD(%)RE(%)批內(nèi)1次1 1.03±0.113.0211.602 1.87±0.19-6.7511.105044.97±1.91-10.104.65800859.33±34.057.424.34批內(nèi)2次1 0.89±0.06-11.107.532 1.89±0.17-5.5810.005054.05±3.368.106.80800737.83±67.74-7.7710.10批內(nèi)3次1 0.92±0.08-7.7010.002 1.78±0.06-11.103.955047.58±1.83-4.834.22800717.83±26.56-10.304.05批間1 0.95±0.07-5.267.772 1.85±0.06-7.813.145048.90±4.69-2.279.57800771.67±76.29-3.549.92

表4 米非司酮和內(nèi)標(biāo)儲備液4℃ 40 d儲存穩(wěn)定性

五、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

結(jié)果顯示，米非司酮在比格犬血漿的基質(zhì)抑制率均<15%(表5)，表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)；通過公式C/B×100%計算提取回收率，結(jié)果顯示米非司酮回收率為91.5%～104.0%(表5)。

六、稀釋效應(yīng)

配置濃度為4 000 ng/ml血漿樣品，將其稀釋5倍，稀釋后濃度800 ng/ml，平行做6份(濃度測定值分別為806、723、724、720、827、697 ng/ml)。結(jié)果顯示RSD 7.10%，RE -6.31%，均符合要求。

表5 LC-MS/MS法測定米非司酮的基質(zhì)效應(yīng)和回收率

討 論

米非司酮是一種抗孕激素，鑒于其可作用于月經(jīng)周期不同時相，且半衰期較長，研究人員考慮將其用于常規(guī)避孕。本課題組曾對25 mg和50 mg米非司酮每周一次口服的臨床效果進(jìn)行初步研究[15]。并在此基礎(chǔ)上，又在全國7家研究所/醫(yī)院完成了對502名婦女(3 006個研究周期)每周一次口服25 mg米非司酮的臨床觀察[16]。研究結(jié)果均提示有希望將米非司酮每周一次口服發(fā)展為常規(guī)避孕方法。另一方面，體內(nèi)外研究均表明米非司酮對于子宮肌瘤等具有很好的治療作用，但目前適宜劑量和方案尚在探索之中。鑒于米非司酮每周一次口服的避孕效果，及其對多種疾病的治療作用，考慮可將其用于特定人群，如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥患者，發(fā)揮避孕和治療疾病的雙重功效。目前已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)認(rèn)證，藥物說明書中明確的僅為將10 mg米非司酮用于成年育齡女性有中重度癥狀的子宮肌瘤術(shù)前治療。同時，鑒于根據(jù)CFDA頒布的《藥品注冊管理辦法》(局令第28號)，在進(jìn)行臨床試驗之前，需要對米非司酮避孕適應(yīng)癥進(jìn)行臨床前研究，評價其安全性和有效性，因此有必要進(jìn)行每周一次口服25 mg米非司酮的藥代動力學(xué)研究，為米非司酮作為兼有治療作用的避孕藥物申請臨床研究做準(zhǔn)備。

目前報道的生物樣本中米非司酮的分析測定方法主要有HPLC法[11-13]和RIA[14]。這兩種方法試劑價格昂貴、步驟繁瑣；RIA法因存在放射性污染，且操作較為煩瑣，不宜推廣使用；HPLC雖然測定較為準(zhǔn)確，但仍存在標(biāo)本流動相配置復(fù)雜，檢測時間長，LLOQ較高等問題[17-18]。楊林等[19]采用LC-MS/MS法測定人血漿中米非司酮濃度，其LLOQ值為10 ng/ml，上樣量為200 μl。林琳等[20]也采用LC-MS/MS法測定兩種米非司酮片人體生物學(xué)效性，其LLOQ值為10.29 ng/ml，上樣量為200 μl。研究文獻(xiàn)中報道的LC-MS/MS法，靈敏度雖已較高，但仍不能滿足本研究對低劑量米非司酮藥代動力學(xué)研究的需要，且部分方法操作較為煩瑣，有待于進(jìn)一步簡化。

本研究在靈敏度、樣品前處理和樣本需求量等方面進(jìn)一步優(yōu)化分析條件，所建立的LC-MS/MS法測定比格犬血漿中的米非司酮，線性范圍寬(1 000倍)，靈敏度高，血漿中米非司酮的線性范圍均為1～1 000 ng/ml，樣品回收率高，能夠滿足給藥后各個時間點(diǎn)血漿藥物濃度的測定。在本測定條件下的穩(wěn)定性考察中，米非司酮含藥基質(zhì)的各濃度偏差均在±15%以內(nèi)，能夠保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。本研究所建立的分析方法靈敏度可達(dá)1.0 ng/ml，且所需樣本量僅為血漿50 μl，為進(jìn)行每周口服25 mg米非司酮片的人體藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。