診治山羊口瘡病例

毛從劍，張煥容，張興民

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041)

羊口瘡是由羊口瘡病毒引起的以患羊口唇、口角、鼻、乳房等部位皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂為特征的傳染病。各年齡段的羊均能感染發(fā)病，山羊比綿羊易感，其中羔羊最易感，并常為群發(fā)性流行。該病一年四季均可發(fā)生，無明顯的季節(jié)性，但多發(fā)于初春或春末夏初。截止到2014年，我國有24個省份報道過羊口瘡病例的發(fā)生，且從2000年起，該病的報道逐年遞增[1]，說明在我國養(yǎng)羊業(yè)中該病的發(fā)生及對該病的關(guān)注越來越多。該病發(fā)病嚴(yán)重時會導(dǎo)致患病羊進(jìn)食困難、營養(yǎng)攝入不足而生長緩慢甚至死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。2017 年 4 月，成都某山羊養(yǎng)殖場出現(xiàn)羔羊口瘡疫情，主訴：該群母羊未免疫口瘡疫苗，羔羊出生后也未免疫口瘡疫苗。該口瘡病例診治情況報告如下。

1 發(fā)病情況

2017年4月，成都某山羊養(yǎng)殖場2周齡左右的哺乳羔羊先后出現(xiàn)不同程度的唇部、嘴角部及舌面紅腫、生瘡、疣狀增生、部分病羊患部后期結(jié)痂后緩慢恢復(fù)健康，該病采用抗生素于患病部位局部注射或涂擦治療無明顯效果，羊只發(fā)病率較高，但較少死亡。

2 臨床及剖檢病變

臨床可見病羊的唇部、嘴角部及口腔內(nèi)側(cè)壁及舌部生瘡、進(jìn)一步發(fā)展口唇部疣狀增生(見中插彩版圖1)，發(fā)病后期口瘡結(jié)痂(見中插彩版圖2)，頸前淋巴結(jié)化膿、腫大，其他臟器無明顯病變。

3 實驗室診斷

3.1 病料采集及處理 無菌采取羔羊口唇及口腔病變組織。取病變組織用無菌PBS漂洗3次后剪碎研磨，按1∶3 (W/V)加入無菌PBS制成混懸液，置-80 ℃凍融3次后加入終濃度為2 000 U/mL的雙抗，4 ℃過夜，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液分裝至離心管，置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2 病毒分離培養(yǎng)情況 MDBK細(xì)胞鋪滿至瓶底的80%左右時，將培養(yǎng)液棄去，用Hank′s洗滌1～3次，加入1.5 mL處理保存的病毒液，在37 ℃，5%CO2條件下感作1 h左右，棄去瓶內(nèi)液體，加入含1%雙抗和1%犢牛血清的DMEM細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，并逐日觀察細(xì)胞，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。連續(xù)盲傳至第5代時，出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、聚積、脫落；連續(xù)傳代至第10代，細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)在接毒后96 h。

3.3 核酸提取及PCR檢測結(jié)果 用酚-氯仿法提取病變組織及細(xì)胞培養(yǎng)總DNA作為模板，PCR擴增檢測羊口瘡病毒B2L基因片段。采用文獻(xiàn)[2]的引物序列如下：上游5′-CAC GGC CAC GAA CTT CCA CCT CAA-3′，下游5′-TCC CGC TCG AAG ACC GCA GAC AG-3′；預(yù)期目的片段大小為540 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：PremixTaq12.5 μL，模板DNA 2. 0 μL，上下游引物各1. 0 μL，加ddH2O補足至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast序列比對后，確定擴增片段為羊口瘡病毒的B2L基因片段，表明從發(fā)病羊口唇部病變組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中均能擴增出特異性的羊口瘡病毒B2L基因片段。

4 診斷結(jié)果

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變和羊口瘡病毒B2L基因片段擴增結(jié)果，確診該養(yǎng)殖場發(fā)生羊口瘡病例。

圖3 MDBK正常對照細(xì)胞 (10×)

圖4 MDBK產(chǎn)生細(xì)胞病變細(xì)胞 (10×)

圖5 PCR電泳圖

5 感染血清制備及應(yīng)用

5.1 感染血清制備 對發(fā)生口瘡2周齡以上的病羊無菌采取頸靜脈血，將血液放入離心管中，待血液凝固后5 000 r/min離心10 min，吸出血清裝至離心管中，加入終濃度為0.01%硫柳汞，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2 感染血清的應(yīng)用 將制備好的感染血清用于剛發(fā)病的羔羊，每只羔羊口唇部肌肉注射1 mL，間隔兩天再注射1次，同時配合抗生素治療，結(jié)果初發(fā)口瘡的病羔羊病情得到有效控制，一般在康復(fù)血清治療后1周左右完全恢復(fù)健康。

6 討論

根據(jù)病羊的典型臨床癥狀，初步診斷為羊口瘡病例，為了確診，從具有典型羊口瘡臨床癥狀的發(fā)病黑山羊口唇部及口腔病變組織采集病料，用MDBK細(xì)胞作為病毒增殖細(xì)胞，盲傳至第5代時出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變，病變細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉網(wǎng)、脫落現(xiàn)象，與殷震[3]等描述的羊口瘡病毒致細(xì)胞病變特征基本一致，并在羊口唇部及口腔病變組織、細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測到了羊口瘡病毒特異性B2L基因片段，確診該起病例為羊口瘡病毒感染所導(dǎo)致。

近年來我國山羊口瘡發(fā)病率不斷上升，且羔羊

發(fā)生羊口瘡的日齡越來越小，1周齡內(nèi)羔羊發(fā)生口瘡的現(xiàn)象越來越多，在此情況下，疫苗接種新生羔羊來不及起到有效保護作用，因此，只有通過母源抗體讓羔羊出生后就能獲得被動免疫保護。有研究表明，在孕羊產(chǎn)前接種羊口瘡滅活疫苗2～3次，對新生羔羊有很好的保護效果[4-5]。本次山羊羔口瘡疫情連續(xù)發(fā)生，持續(xù)1月以上，是由于該群母羊沒有接種口瘡疫苗，羔羊出生后也未免疫口瘡疫苗，通過采用先期發(fā)病后至少兩周的病羊血清治療后期初發(fā)病的羔羊，對初發(fā)口瘡病羔羊的病情得到了有效的控制，證明特異性的感染血清可用于初發(fā)口瘡病羔羊的緊急救治[6]，特異性的抗病血清對初發(fā)口瘡的病羔的治療作用與母源抗體對后代羔羊的早期被動免疫保護作用是一致的。目前，對羊口瘡病還沒有特效治療藥物，因此對羊群的免疫接種是預(yù)防該病的關(guān)鍵，本病例中畜主未對母羊進(jìn)行免疫，也未對初生羔羊進(jìn)行口瘡疫苗的接種，是導(dǎo)致該養(yǎng)殖場暴發(fā)羊口瘡病例的根本原因。此外羊口瘡病毒主要是由結(jié)痂病料引起的環(huán)境污染經(jīng)受損的皮膚、黏膜感染機體，因此在日常管理中要注意保護羊只的皮膚、黏膜免受損傷；對羊舍、用具及周圍環(huán)境及時消毒，以減少羊口瘡病的發(fā)生。