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    ELISA聯(lián)合NAT技術(shù)在獻血者血液篩查和輸血殘余風(fēng)險分析中的應(yīng)用

    2018-10-15 09:18:50徐利強李建華倪修文孫亞云吳瑾惠毛惠娜
    關(guān)鍵詞:獻血者標(biāo)志物試劑盒

    徐利強 李建華 倪修文 孫亞云 吳瑾惠 毛惠娜

    314000嘉興市中心血站

    輸血是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染途徑之一[1]。我國采供血機構(gòu)現(xiàn)主要通過2種不同產(chǎn)家酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒檢測獻血者血液HBsAg判斷是否存在HBV感染,有效降低了輸血HBV感染的發(fā)生率。但獻血人群中存在一定比例的窗口期(WP)感染和隱匿性感染(OBI)HBV感染者,其HBsAg檢測呈陰性,此部分血液輸血存在HBV感染風(fēng)險[2-3]。核酸擴增檢測技術(shù)(NAT)是近年在獻血者血液篩查中開展的病毒核酸檢測方法[4]。本研究用ELISA聯(lián)合NAT技術(shù)對獻血者進行血液檢測,并對HBsAg-/HBV DNA+進行HBV DNA定量和血清學(xué)分析,旨在探討屏蔽HBsAg-且NAT單反應(yīng)樣本對預(yù)防經(jīng)輸血傳播HBV的意義。

    1 材料與方法

    1.1 血標(biāo)本來源 2015年1月至2015年12月嘉興市中心血站按 《獻血者健康檢查要求》(GB18467-2011)經(jīng) ALT、HB、HBsAg和 TP 聯(lián)合金標(biāo)試劑條初篩合格,采集45 551份獻血者血液樣本,同步留取兩份血液樣本各5 ml(EDTA抗凝)。26 101份和19 450份來自男性和女性,年齡18~60歲。

    1.2 OBI和WP確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn) OBI確認(rèn)需要滿足下面兩個條件:①血液標(biāo)本血液篩查和補充鑒別試驗后確定病毒類型為HBsAg-/HBV DNA+;②血液標(biāo)本首次檢測出乙肝表面標(biāo)志物或乙肝三系結(jié)果全陰,在追蹤回溯時其血清學(xué)乙肝表面標(biāo)志物不發(fā)生明顯變化。WP確認(rèn)需要滿足下面幾個條件:①血液標(biāo)本血液篩查和補充鑒別試驗后確定病毒類型為HBsAg-/HBV DNA+;②血液標(biāo)本首次檢測乙肝三系血清學(xué)結(jié)果全陰,在追蹤回溯時其HBsAg轉(zhuǎn)陽,以及其他標(biāo)志物也陸續(xù)出現(xiàn)。

    1.3 HBsAg和HBV-DNA定性檢測 對初篩為HBsAg陰性的血標(biāo)本采用2種不同的酶免疫試劑盒(北京萬泰、廈門新創(chuàng)、上??迫A和意大利索靈生產(chǎn))酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測HBsAg選出HBsAg-樣本。采用美國諾華檢測系統(tǒng)(Procleix Tigris)進行三聯(lián)熒光病毒單人份核酸擴增檢測技術(shù)(NAT)檢測,對有反應(yīng)的標(biāo)本再進行核酸鑒別試驗來檢測病毒類型,以確定HBV DNA是否為陽性(HBV DNA+)。上述檢測獲得HBsAg-/HBV DNA+樣本。

    1.4 乙肝兩對半檢測 所有HBsAg-/HBV DNA+樣本 ELISA檢測血清標(biāo)志物抗-HBs(HBsAb)、HBeAg、抗-HBe(HBeAb)和抗-HBc(HBcAb)(試劑盒購自上海榮盛)。乙肝兩對半檢測結(jié)果均陰性的HBV DNA+獻血者,多為HBV感染窗口期,進一步跟蹤隨訪確定結(jié)果。

    1.5 HBV病毒載量測定 采用實時熒光-PCR(RT-PCR)進行 HBV DNA定量,檢測儀器為 ABI 7500實時熒光PCR儀,試劑盒購自廣州中山達安基因股份有限公司,檢測下限為20 IU/ml。按說明書提示提取研究對象的HBV DNA,選用北京康徹斯坦低值和高值為HBV室內(nèi)質(zhì)控品。PCR參數(shù):93℃2 min;93 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s,10 個循環(huán);93 ℃ 30 s、55℃ 45 s,30個循環(huán)至反應(yīng)結(jié)束。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理,對分類變量資料采用用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 OBI分布 45 551份獻血者樣本中,44份HBsAg-/HBV-DNA+,其中3份乙肝兩對半檢測結(jié)果均為陰性,作窗口期處理,按窗口期進行跟蹤隨訪,隨訪結(jié)果2例出現(xiàn)血清學(xué)標(biāo)志物轉(zhuǎn),另1例血清學(xué)標(biāo)志物幾乎無明顯變化,根據(jù)OBI和WP確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn),確認(rèn)OBI 42例,WP2例。42份獻血者確認(rèn)OBI,檢出率為0.90‰,33例 OBI為男性 OBI檢出率1.26‰(33/26101),9 例女性 OBI檢出率 0.46‰(9/19 450)不同性別獻血人群OBI檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.77,P <0.01)。 15例 OBI來自首次獻血者檢出率0.63‰(15/23 732),27例OBI來自重復(fù)獻血者檢出率1.24‰(27/21819),兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.59,0.01<P<0.05)。3組年齡組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.91,P<0.01),以41~60歲年齡組獻血者 OBI檢出率最高1.84‰,明顯高于其他組(χ2=16.37和5.92,P<0.05)為比例最高。 見表1。

    表1 總獻血者篩查人數(shù)與隱匿性乙肝(OBI)人群一般資料的分布特征Tab.1 Distribution characteristics of the general data of screening for total blood donors and occult hepatitis B infection (OBI) population

    2.2 HBsAg-/HBV-DNA+樣本HBV DNA定量檢測結(jié)果 42份OBI樣本HBV DNA濃度范圍<20~1.82 ×103IU/ml,中位數(shù) 32.6 IU/ml,HBV DNA 濃度<20 IU/ml的 32份占 OBI樣本 76.2%,HBV DNA濃度范圍為20~100 IU/ml的8份占OBI樣本19.0%,另有2份 HBV DNA濃度 >100 IU/ml占OBI樣本4.8%。2份WP樣本HBV DNA分別為61.5 IU/ml和 24.1IU/ml。

    表2 HBsAg-/HBV-DNA+樣本血清學(xué)檢測結(jié)果Tab.2 HBsAg-/HBV-DNA + sample serological test results

    2.3 HBsAg-/HBV-DNA+樣本血清學(xué)檢測結(jié)果見表2。44份NAT單反應(yīng)陽性樣本中2份來自WP獻血者,42份來自O(shè)BI獻血者。OBI獻血者中5項血清學(xué)檢測指標(biāo)全部陰性(模式-1)1份(2.3%);模式-2除HBsAb陽性外,其余4項血清學(xué)指標(biāo)陰性共2份(4.8%);模式-3為指標(biāo)HBcAb單項陽性共 4份占9.5%;模式-4為 HBeAb和HBcAb同時陽性共8份占19.0%;模式-5為HBsAb和HBcAb同時陽性共22份占52.4%(為本研究最常見血清學(xué)模式);模式-6為 HBsAb、HBeAb和HBcAb同時陽性共5份占11.9%。5項血清學(xué)檢測結(jié)果HBcAb陽性最多39例占92.9%,其中30份(76.9%)HBV DNA 定量 <20 IU/ml(HBV DNA 確認(rèn)陰性),9份(23.1%)HBV DNA定量≥20 IU/ml確認(rèn)陽性。HBeAb和 HBcAb同時陽性13份占29.5%,其中11份(84.6%)HBV DNA定量 <20 IU /ml。

    3 討論

    HBV感染呈全球流行,我國人群HBsAg攜帶率為7.18%,HBV感染的主要方式是通過血液傳播,因此對獻血者血液進行HBV篩查和HBV感染殘余風(fēng)險檢測仍是保證輸血安全的重要環(huán)節(jié)[5]。文獻報道ELISA檢測血清HBsAg結(jié)果呈陰性導(dǎo)致獻血者存在HBV感染漏檢可能,常見的有OBI和WP兩種特殊的HBV感染狀態(tài)[2-3]。隨著核酸檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用,《2015版血站技術(shù)操作規(guī)程》推薦用ELISA和NAT聯(lián)合檢測獻血者血液,具有更好的靈敏度的NAT用于獻血者血液篩查,旨在利用NAT提高低水平的HBV DNA的OBI人群的檢測效率。本研究用ELISA和NAT聯(lián)合檢測45 551份經(jīng)過初篩的獻血者樣本,3份疑似WP按規(guī)定進行跟蹤隨訪,隨訪結(jié)果2例出現(xiàn)血清學(xué)標(biāo)志物轉(zhuǎn)陽,另1例血清學(xué)標(biāo)志物幾乎無明顯變化,最終確認(rèn)分別有2份和42份為 WP和 OBI。OBI檢出率 1∶1 085(0.92‰)與中國臺灣1∶1 022 接近[6],高于西安 1∶1 628[7]、大連 1∶2 293[8]、深圳 1∶3031 和亞洲東南亞地區(qū)的報道[9],但低于福建 1∶569[10]、遠(yuǎn)低于西非加納城市人口的1:67[11]。 與上述研究一致,不同性別、年齡和獻血次數(shù)與OBI檢出率的有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究用的RT-PCR試劑盒檢測下限為20 IU/ml,結(jié)果42例 OBI獻血者血液中 32份 HBV DNA濃度<20IU/ml、8份HBV DNA濃度范圍在20~100 IU/ml,而2份 WP血清 HBV DNA濃度分別是61.48 IU/ml和 24.10IU/ml,OBI和 WP 獻血者血液病毒載量都非常低,提示利用NAT技術(shù)可有效檢出獻血者血清中HBV-DNA,極大地降低了輸血感染 HBV 的風(fēng)險[12]。

    NAT技術(shù)應(yīng)用HBsAg-獻血者血液HBV核酸檢測可有效降低輸血感染HBV的風(fēng)險,主要原因有:①NAT為定性檢測有較高靈敏度,本研究用的RTPCR定量試劑盒檢測下限為20 IU/ml,結(jié)果30份OBI獻血者中HBV DNA定量<20 IU/ml、8份HBV DNA濃度范圍在20~100 IU/ml,2份WP血清HBV DNA 濃度分別是61.48 IU/ml和24.10IU/ml,40 份低拷貝血液用定性NAT檢測HBV DNA均能有效檢出。②本研究中有1例疑似窗口獻血者跟蹤結(jié)果血清標(biāo)志物沒有變化可能是OBI的S區(qū)基因突變導(dǎo)致“a”決定簇(124-147AA)和主要親水區(qū)(MHR,99-169AA)氨基酸的改變,影響HBsAg表達,以及感染者機體細(xì)胞免疫和體液免疫引起HBV囊膜蛋白改變,所有綜合效應(yīng)導(dǎo)致機體對HBV處于免疫耐受狀態(tài),核酸病毒低拷貝復(fù)制,免疫標(biāo)志物蛋白不能正常表達和分泌,因此所有血清學(xué)指標(biāo)均陰性,但NAT仍能有效檢出其病毒核酸。③我們檢測到2例HBsAb陽性而其余4項陰性樣本,提示這些獻血者機體通過天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的協(xié)調(diào)作用清除HBV病毒,但NAT陽性也表明OBI獻血者免疫功能受到抑制或免疫低下不能有效清除HBV,處于慢性感染狀態(tài),此類獻血者血液中仍殘留病毒,存在輸血感染的可能性。④另外HBcAb是既往感染標(biāo)志,可認(rèn)為其為OBI血清學(xué)一種重要特征,有很好的指導(dǎo)價值。國外低流行區(qū)有利用HBcAb和HBsAb定量來綜合判斷血液的保留還是淘汰。我國在正常人群中HBcAb陽性率也接近50%,所以用HBcAb作為血篩一個指標(biāo)勢必會誤淘汰部分獻血者會導(dǎo)致浪費血源。本研究OBI獻血者39份HBcAb陽性,且血清HBV DNA病毒載量多數(shù)小于20 IU/ml,而NAT仍能有效檢出。

    綜上所述,無論HBV DNA定量是否高于檢測下限,NAT反應(yīng)性標(biāo)本均與HBV感染具有較高的相關(guān)性,ELISA和NAT聯(lián)合檢測比2種不同ELISA試劑盒檢測獻血者血液更能有效檢出獻血者血液中HBV,可進一步縮短病毒感染的窗口期,極大地降低了經(jīng)血傳播疾病的殘余風(fēng)險,保障了受血者輸血安全性。

    利益沖突 無

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