細(xì)胞因子基因多態(tài)性與肺結(jié)核并發(fā)糖尿病易感性的相關(guān)性研究

董斯佳 袁立 陳誠(chéng) 蔣偉利 趙琦

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性感染性疾病，世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]2017年全球結(jié)核病報(bào)告指出，2016年全球新發(fā)結(jié)核病1040萬例，約160萬例死亡，是世界范圍內(nèi)第九大死因，也是單一傳染因素的首要原因。糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組由遺傳和環(huán)境等因素共同作用導(dǎo)致的慢性代謝性疾病，其特點(diǎn)是慢性的高血糖伴發(fā)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。研究表明，兩病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸存在密切聯(lián)系[2-3]，TB并發(fā)DM(tuberculosis and diabetic mellitus，TB-DM)已成為威脅人類生命和健康的重大衛(wèi)生問題[4]。由于TB和DM的發(fā)生均與遺傳因素有關(guān)，探索遺傳因素在TB-DM發(fā)病機(jī)制中的作用能夠?yàn)榻窈箝_展基于TB-DM高危人群的基因遺傳篩查和預(yù)防TB-DM的發(fā)生有重要意義[5]。既往研究顯示，許多基因均被證明與TB和DM的易感性存在關(guān)聯(lián)，其中白細(xì)胞介素 10(IL-10)和γ-干擾素(IFN-γ)受到廣泛關(guān)注[6-10]；但與共患疾病相關(guān)基因多態(tài)性及其差異的報(bào)道較少，目前涉及的包括人類淋巴細(xì)胞抗原(HLA)基因、Toll樣受體4(TLR4)、IL-10等[11]。本研究以肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)并發(fā)DM(pulmonary tuberculosis and diabetic mellitus，PTB-DM)患者、PTB患者、DM患者為研究對(duì)象，通過選取與PTB和DM易感性相關(guān)、關(guān)注較多的IFN-γ和IL-10作為候選基因，研究其與疾病共患易感性的關(guān)系，探索PTB-DM發(fā)病的危險(xiǎn)因素和發(fā)病機(jī)制。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

1.一般情況：采取目的性抽樣方法，抽取華東地區(qū)江蘇省內(nèi)徐州市下轄的新沂市和睢寧縣、南京市鼓樓區(qū)作為研究現(xiàn)場(chǎng)，選取2013年4月1日至2014年3月31日間上述研究現(xiàn)場(chǎng)TB防治定點(diǎn)機(jī)構(gòu)新診斷登記的142例涂陽PTB-DM患者(PTB-DM 組)，并同期選取新診斷的147例PTB患者(PTB組)、141例DM患者(DM組)作為對(duì)照，共計(jì)430例納入研究。142例PTB-DM患者中，男95例(66.90%)、女44例(33.10%)，性別缺失3例，平均年齡為(50.22±18.86)歲；147例PTB患者中，男102例(69.39%)、女45例(30.61%)，平均年齡為(49.58±19.40)歲；141例DM患者中，男96例(68.09%)、女45例(31.91%)，平均年齡為(53.00±16.15)歲。三組間年齡(F=1.422，P=0.242)和性別(χ2=0.064，P=0.969)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間具有可比性。

2.患者納入標(biāo)準(zhǔn): (1) PTB診斷依據(jù)《WS 288—2008 肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)[12]，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢查 (痰涂片萋-尼染色鏡檢)、胸部影像學(xué)檢查、流行病學(xué)資料、臨床表現(xiàn)，以及必要的輔助檢查進(jìn)行綜合分析。本研究納入者均為涂陽PTB患者。(2) 診斷DM時(shí)，所有患者在治療前均檢測(cè)空腹血糖，若空腹血糖≥7.0 mmol/L則進(jìn)一步行糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)檢測(cè)，若GHb≥6.5%則確診為DM。

3.患者排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均排除自身免疫性疾病、肝腎疾病、過敏性疾病、腫瘤等。(2)近3個(gè)月來罹患肺炎，或者服用糖皮質(zhì)激素、利尿劑等特殊藥物，或抽取靜脈血當(dāng)日體溫超過38.5 ℃者均不入組。

二、研究方法

1.問卷調(diào)查：采用統(tǒng)一自行設(shè)計(jì)的調(diào)查表[13]，由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查員填寫并每個(gè)月對(duì)收集的調(diào)查問卷進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)質(zhì)量控制。內(nèi)容包括調(diào)查對(duì)象的一般人口學(xué)特征(包括性別、年齡等)、社會(huì)特征、經(jīng)濟(jì)學(xué)信息(包括受教育程度、經(jīng)濟(jì)狀況等)、慢性病病史(特別是DM病史及家族史等)，以及DM相關(guān)危險(xiǎn)因素調(diào)查(如飲食、運(yùn)動(dòng)習(xí)慣等)；PTB患者另附調(diào)查相關(guān)就診經(jīng)歷、治療經(jīng)歷；DM患者另附DM診療經(jīng)歷等信息收集表。共計(jì)發(fā)放問卷430份，回收430份，有效問卷430份。

2.基因組DNA提?。航?jīng)研究對(duì)象知情同意后，采集外周靜脈血5 ml，置于抗凝管中，采用1 ml血液基因組DNA提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)，按照說明書方法提取DNA，于-80 ℃深低溫冰箱凍存。

3.IFN-γ和IL-10單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)選擇：參考已有文獻(xiàn)報(bào)道[6-9, 11]的與PTB-DM、DM、TB易感性均存在關(guān)聯(lián)的功能性SNP位點(diǎn)，最終將IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A納入研究。

4.PCR擴(kuò)增：采用上海生工生物工程公司PCR擴(kuò)增試劑盒，引物序列由上海生工生物公司合成。IFN-γ+874A/T上游為5′-AAAACAGCAAAGCCACCC-3′，下游為5′-TTTTATTCTTACAACACAAAATCAGA-3′；IL-10 -592A/C上游為5′-TCCAGCCACAGAGCTTACAAC-3′，下游為5′-AGGTCTCTGGGCCTTAGTTTCC-3′；IL-10 -1082G/A上游為5′-CCAAGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3′，下游為5′-GCTTCTTAT-ATGCTAGTCAGGTA-3′。PCR反應(yīng)總體積為15 μl，其中DNA 0.5 μl、上游引物0.2 μl、下游引物0.2 μl、預(yù)混液(Mix) 3.1 μl、水(dH2O)11 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min、變性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；共20個(gè)循環(huán)，每次-0.5 ℃。隨后再進(jìn)行20個(gè)循環(huán)反應(yīng)(每個(gè)循環(huán)包括95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s、72 ℃ 6 min)，最后72 ℃延伸6 min。

5.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP) 鑒定：擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Bg1Ⅱ(IFN-γ+874A/T)、RsaⅠ(IL-10 -592A/C)、EcoNⅠ(IL-10 -1082G/A)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，根據(jù)電泳圖中條帶的數(shù)目判斷基因型。各基因位點(diǎn)分型標(biāo)準(zhǔn)：IFN-γ +874A/T位點(diǎn)基因型分別為AA(182 bp)、AT(182 bp、161 bp、21 bp)、TT(161 bp、21 bp)，IL-10 -592A/C位點(diǎn)基因型分別為AA(236 bp、176 bp)、AC(412 bp、236 bp、176 bp)、CC(412 bp)，IL-10 -1082G/A 位點(diǎn)基因型分別為GG(253 bp、97 bp、27 bp)、GA(280 bp、253 bp、97 bp、27 bp)、AA(280 bp、97 bp)。

依上至下分別為 IFN-γ+874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A 位點(diǎn)的酶切結(jié)果電泳圖，各圖中位置9為Marker圖1 基因多態(tài)性位點(diǎn)酶切結(jié)果電泳圖

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，以明確群體是否具有遺傳平衡，若符合遺傳平衡則證明本次研究所選對(duì)象基因和基因型頻率沒有發(fā)生遷移、突變和選擇，樣本來自遺傳平衡狀態(tài)的人群，符合大群體中基因頻率和基因型頻率的遺傳規(guī)律，群體的遺傳性能相對(duì)穩(wěn)定，具有一定代表性。

采用在線分析軟件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)對(duì)IL-10 -592A/C和-1082G/A位點(diǎn)之間進(jìn)行連鎖不平衡分析,以說明某些組合單倍型在遺傳適應(yīng)性上具有優(yōu)勢(shì)，以P<0.05表示SNP之間存在連鎖不平衡，以相對(duì)大小D′和相關(guān)系數(shù)r2表示SNP之間存在的連鎖不平衡程度[14]，但由于SHEsis在線軟件進(jìn)行單倍型分析時(shí)，有些單倍型的頻率非常低，很有可能會(huì)影響分析結(jié)果而產(chǎn)生偏差，故本研究將最低頻率閾值設(shè)定為0.03，所有頻率低于0.03的單倍型其分布差異不予分析；并用該軟件進(jìn)一步分析IL-10 -592A/C和-1082G/A位點(diǎn)單倍型與PTB-DM易感性的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、基因多態(tài)性位點(diǎn)分型鑒定結(jié)果

IFN-γ+874A/T、IL-10-592A/C、IL-10-1082G/A位點(diǎn)經(jīng)PCR擴(kuò)增和基因多態(tài)性位點(diǎn)分型鑒定，獲得本次研究對(duì)象等位基因(分別為A、T，A、C、G、A)和基因型(分別為AA、AT、TT，AA、AC、CC、GA、AA)的構(gòu)成情況，為后續(xù)共患疾病易感性相關(guān)性的分析提供等位基因和基因型范圍。各組IL-10 -1082G/A位點(diǎn)可能的基因型有GG、GA、AA等3種，但GG基因型在3個(gè)組的研究對(duì)象中均未檢測(cè)到。

二、Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)

對(duì)3個(gè)組研究對(duì)象各位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)，顯示IFN-γ+874A/T位點(diǎn)上PTB組不符合Hard-Weinberg遺傳平衡(χ2=6.700，P=0.009)，而DM組和PTB-DM組該位點(diǎn)上均符合遺傳平衡(P值均>0.05)；IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點(diǎn)上3個(gè)組均符合Hard-Weinberg遺傳平衡(P值均>0.05)，見表1。

三、單個(gè)SNP位點(diǎn)與PTB-DM易感性相關(guān)性分析

1.各位點(diǎn)等位基因頻率與PTB-DM易感性相關(guān)性分析：3個(gè)組的研究對(duì)象在IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A等3個(gè)位點(diǎn)的A等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.750、0.135、0.130)。進(jìn)一步兩兩比較，在IFN-γ +874A/T和IL-10 -592A/C 2個(gè)位點(diǎn)上，PTB-DM組和PTB組、PTB-DM組和DM組之間等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；在IL-10 -1082G/A位點(diǎn)上，PTB-DM組和PTB組A等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.146)，而PTB-DM組和DM組等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)，見表2。

表1 各位點(diǎn)基因型在不同組中的Hard-Weinberg檢驗(yàn)情況

注預(yù)期頻數(shù)為根據(jù)平衡公式求得的平衡狀態(tài)時(shí)的理論頻數(shù)，觀察頻數(shù)為樣本中實(shí)際頻數(shù)，可能會(huì)出現(xiàn)基因位點(diǎn)檢測(cè)不到，導(dǎo)致頻數(shù)少于患者例數(shù)。理論值與實(shí)際值完全一致時(shí)，認(rèn)定為平衡群體；如不一致，則通過卡方檢驗(yàn)判斷其在兩組間的分布是否有差異，以P>0.05界定來自平衡群體

2.各位點(diǎn)基因型頻率與PTB-DM易感性相關(guān)性分析：在IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A 3個(gè)位點(diǎn)上，三組間的基因型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，詳見表3。

3.logistic回歸分析：校正年齡和性別對(duì)結(jié)果的影響后，在PTB-DM組與PTB組、PTB-DM組與DM組間，以是否發(fā)生共患為因變量，以各種基因模型為自變量，對(duì)PTB-DM組與PTB組、DM組位點(diǎn)基因型頻率分別進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果顯示，PTB-DM組與PTB組的IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A位點(diǎn)基因型頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PTB-DM組與DM組間IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C位點(diǎn)基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與IL-10 -1082G/A位點(diǎn)基因型頻率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在DM組患者中，基因型為AA的患者發(fā)生PTB-DM的風(fēng)險(xiǎn)是基因型為GA患者的 1.970倍(aOR=1.970；95%CI: 1.066～3.643)，見表4。

表2 研究對(duì)象各類等位基因在各組中發(fā)生頻率的比較

注a：PTB-DM 組、PTB 組、DM 組三組比較；b：PTB-DM 組與 PTB 組比較；c：PTB-DM 組與 DM 組比較

表3 研究對(duì)象各類基因型在各組中發(fā)生頻率的單因素分析

表4 研究對(duì)象各類基因型在各組中發(fā)生頻率的多因素logistic回歸分析

注表中“-”為無檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

四、基因內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)情況

1.連鎖不平衡分析結(jié)果：在PTB-DM組及PTB組、DM組中，IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點(diǎn)間存在連鎖不平衡(D′=0.959，r2=0.181，P<0.001)。

2.單倍型分析結(jié)果：運(yùn)用單倍型分析軟件估計(jì)IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點(diǎn)單倍型頻率，并分別比較PTB-DM組和PTB組、PTB-DM組和DM組之間單倍型頻率分布，結(jié)果顯示，本次研究人群中，IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點(diǎn)共存在4種單倍型，分別為A-A、A-G、C-A、C-G，在3個(gè)組中的出現(xiàn)頻率均超過3%的單倍型組合(組內(nèi)頻率>0.03)為A-A、C-A、C-G；A-G可能低于最低頻率閾值0.03，本研究中不予分析其分布差異。

PTB-DM組、PTB組、DM組的A-A、C-A、C-G單倍型頻率分布詳見表5、6，PTB-DM組和PTB組的3種單倍型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PTB-DM組和DM組的A-A、C-G單倍型頻率差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但C-A單倍型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

研究表明，TB患者罹患DM的可能性比正常人群更高，可導(dǎo)致TB病情遷延不愈，傳染性難以控制，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全和人群健康；而DM患者對(duì)TB的易感性也大大增加，共患可使DM患者病情加重，血糖控制難度增加，并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增高，顯著增加了糖尿病的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本[2-3]。故認(rèn)為DM患者是預(yù)防TB發(fā)生的重要靶向人群，在DM患者中積極預(yù)防TB的發(fā)生，一方面可以在一定程度上減緩TB疫情的發(fā)展和蔓延，另一方面也有利于降低DM和TB的病死率[4]。本研究通過研究IFN-γ和IL-10基因位點(diǎn)多態(tài)性與PTB和DM易感性的關(guān)系，了解遺傳因素在疾病共患機(jī)制中的作用，為日后基于基因多態(tài)性的共患高危人群篩查提供科學(xué)依據(jù)。

表5 IL-10 基因單倍型頻率在PTB-DM組與PTB組間的比較

注“頻數(shù)”為頻率×總體個(gè)數(shù)得到的預(yù)期數(shù)，為軟件估算得到；“-”指A-G可能低于最低頻率閾值0.03，本研究中不予分析其分布差異

表6 IL-10 基因單倍型頻率在PTB-DM組與DM組間的比較

注“頻數(shù)”為頻率×總體個(gè)數(shù)得到的預(yù)期數(shù)，為軟件估算得到；“-”指A-G可能低于最低頻率閾值0.03，本研究中不予分析其分布差異

一、細(xì)胞因子基因單個(gè)SNP位點(diǎn)與PTB-DM易感性的相關(guān)性分析

基因位點(diǎn)多態(tài)性是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在差異，即基因組中散在堿基不同，單個(gè)堿基的置換又稱為SNP，是基因多態(tài)性的一種形式[15]。IL-10是一類重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞和胸腺細(xì)胞產(chǎn)生。既往針對(duì)IL-10基因位點(diǎn)多態(tài)性與疾病易感性的研究結(jié)果顯示，IL-10的-1082G/A位點(diǎn)、-819C/T位點(diǎn)和 -592A/C位點(diǎn)被證明與多種疾病有關(guān)，如肝硬化[16]、甲狀腺癌[17]、白血病[18]等，當(dāng)然也包括TB和DM。但目前針對(duì)PTB-DM的基因位點(diǎn)多態(tài)性的研究尚十分稀少，僅有Garcia-Elorriaga 等[19]在2013年對(duì)21例PTB-DM患者、77例TB患者和60名健康對(duì)照者進(jìn)行IL-10 -1082G/A位點(diǎn)和-592C/A位點(diǎn)的基因型檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，PTB-DM患者的IL-10 -592AA和IL-10 -592CC 基因型頻率均明顯高于健康對(duì)照者，而IL-10 -1082GG低于健康對(duì)照者，提示IL-10基因多態(tài)性可能與PTB-DM易感性有關(guān)。但該研究樣本量過小、健康對(duì)照定義不夠明確、對(duì)照組的年齡與患者組并不匹配等，導(dǎo)致結(jié)論的科學(xué)性較局限。

本次研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 -1082G/A位點(diǎn)等位基因和基因型頻率分布在PTB-DM患者及DM患者中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PTB-DM組-1082G/A位點(diǎn)A等位基因頻率高于DM組，其AA基因型在PTB-DM患者中的頻率明顯高于DM患者，該位點(diǎn)表現(xiàn)為AA基因型的DM患者對(duì)于TB的易感性是表現(xiàn)為GA基因型患者的1.970倍 (95%CI: 1.066～3.643)，提示IL-10 -1082位點(diǎn)的AA基因型可能與PTB-DM易感性有關(guān)，為疾病共患的危險(xiǎn)因素。同時(shí)，PTB-DM與DM患者相比，IL-10 -592A/C位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在DM患者中，IL-10 -592A/C位點(diǎn)的SNP可能與其易感TB無關(guān)；PTB-DM患者與PTB患者相比，IL-10 -1082G/A位點(diǎn)、IL-10 -592A/C位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在PTB患者中，IL-10 -1082G/A位點(diǎn)、IL-10 -592A/C位點(diǎn)的SNP可能與其易感DM無關(guān)。以上陰性結(jié)果與Garcia-Elorriaga等[19]的研究結(jié)果不一致，該研究報(bào)道了共患患者和健康人群間的SNP和易感性的關(guān)聯(lián)，而本研究側(cè)重的是共患患者分別與PTB、DM之間的關(guān)聯(lián)，可能是關(guān)注點(diǎn)的不同導(dǎo)致了一些結(jié)果上的差異；還可能與樣本量大小、研究人種、研究對(duì)象的選擇、實(shí)驗(yàn)方法的不同有關(guān)，有待下一步更大樣本的研究進(jìn)一步證明。另外，本研究中只對(duì)年齡和性別進(jìn)行了控制，未對(duì)更多相關(guān)因素進(jìn)行考慮，該局限性可能導(dǎo)致基因多態(tài)性與疾病易感性之間的相關(guān)性產(chǎn)生一定偏移。本研究未對(duì)不同類別糖尿病進(jìn)行入組限制，由于我國(guó)90%為Ⅱ型糖尿病患者[20]，故本研究結(jié)論適用于肺結(jié)核并發(fā)Ⅱ型糖尿病患者人群，對(duì)其他人群的外推性受到一定程度限制。

IFN-γ是另一類在機(jī)體免疫過程中扮演重要角色的細(xì)胞因子，對(duì)于調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫有重要作用。在既往研究中，IFN-γ +874A/T位點(diǎn)和CA repeats 12/non-12位點(diǎn)均被證明與多類疾病易感性有關(guān)，其中包括TB和DM。在西班牙[21]、南非[22]、中國(guó)[23]患者中，IFN-γ +874A/T位點(diǎn)的AA基因型均被證明增加了罹患TB的風(fēng)險(xiǎn)；在波蘭[24]兒童、 希臘[25]患者中IFN-γ +874A/T位點(diǎn)的A等位基因被證明是DM的易感因素，但既往尚無針對(duì)PTB-DM患者的相關(guān)基因多態(tài)性研究。本次研究中，創(chuàng)新性地探索了IFN-γ +874A/T位點(diǎn)與PTB-DM易感性是否存在相關(guān)性。結(jié)果顯示，IFN-γ +874A/T 位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型分布在PTB-DM組、PTB組、DM組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IFN-γ +874A/T位點(diǎn)可能與DM患者易感TB無關(guān)，也與TB患者易感DM無關(guān)。由于該位點(diǎn)與疾病共患易感性相關(guān)性是首次進(jìn)行研究，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，有待進(jìn)一步大樣本的研究證明。

二、細(xì)胞因子基因內(nèi)位點(diǎn)單倍型頻率與PTB-DM易感性的相關(guān)性分析

既往研究中對(duì)于復(fù)雜疾病相關(guān)基因進(jìn)行定位的方法主要有兩大類，一類是進(jìn)行基于家系數(shù)據(jù)(即親本到子代的數(shù)據(jù))的多位點(diǎn)連鎖分析，另一類則是基于人群數(shù)據(jù)的單倍型分析；當(dāng)致病基因的效應(yīng)相對(duì)較弱時(shí)，一般在研究中采用單倍型的關(guān)聯(lián)分析[26]。本次研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點(diǎn)間存在連鎖不平衡，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析IL-10單倍型與PTB-DM易感性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)C-A 單倍型能增加DM患者共患TB的風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.590，95%CI:1.056～2.396)。而C-A單倍型中IL-10 -1082G/A位點(diǎn)表現(xiàn)為A等位基因，也與前文基因型中相關(guān)發(fā)現(xiàn)一致，進(jìn)一步說明了IL-10 -1082G/A位點(diǎn)可能與PTB-DM易感性有關(guān)。

三、共患患者IL-10 -1082G/A和-592A/C位點(diǎn)等位基因和基因型頻率的差異

本次研究中發(fā)現(xiàn)，在PTB-DM患者人群中，IL-10 -1082G/A位點(diǎn)和-592A/C位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率隨國(guó)家地域分布和種族不同而有所差異。在針對(duì)墨西哥人群的相關(guān)研究中，IL-10 -592A/C位點(diǎn)的AA基因型在PTB-DM人群中僅占5%，而CC基因型占總患者例數(shù)的52%[19]；但在本次研究中，共患患者IL-10 -592A/C位點(diǎn)的AA基因型和CC基因型的頻率分別為44.37%和9.86%，與其分布相差較大。同樣，墨西哥人群中PTB-DM患者IL-10 -1082G/A位點(diǎn)的AA和GG基因型頻率均為29%[19]，而本次研究中，共患患者的AA基因型頻率為85.21%，GG基因型甚至并未檢測(cè)到，提示在不同人群種族中其本身的基因SNP的表現(xiàn)并不相同。也與此前王牡丹等[27]對(duì)我國(guó)浙南地區(qū)健康人群的IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性研究結(jié)果類似。本研究未檢測(cè)到GG基因考慮與人種差異有關(guān)。

綜上所述，對(duì)基因多態(tài)性的研究有助于從免疫學(xué)的角度理解PTB共患DM的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，探索攜帶不同等位基因的個(gè)體對(duì)共患疾病的易感性，為早期篩查、早期治療提供可能性。本次研究中發(fā)現(xiàn)的PTB-DM易感性的相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)尚是冰山一角，我們相信存在更多基因的SNP與兩類疾病的共患易感性有關(guān)，而此類基因及其多態(tài)性尚需要更多的研究證明。