丹參酮 ⅡA對(duì)Adriam誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

，，

(延安市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西 延安 716000)

慢性腎病是一類(lèi)腎功能進(jìn)行性退化的疾病[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有超過(guò)10%的人都患有慢性腎病，嚴(yán)重影響人類(lèi)的身體健康[3]。藥物引起的慢性腎病是臨床常見(jiàn)的慢性腎病之一。阿霉素 (adriamycin,Adriam) 是一類(lèi)蒽環(huán)類(lèi)衍生物，臨床常用于治療癌癥，但其大量的使用可造成腎損傷[4-5]。Adriam引起腎小球損傷，表現(xiàn)為進(jìn)行性蛋白尿，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[6]。目前對(duì)于Adriam引起的慢性腎病的治療方式主要包括透析和腎移植手術(shù)，但由于長(zhǎng)期透析及腎移植手術(shù)費(fèi)用昂貴，僅有1%的慢性腎病患者能從中獲益[1]。因此，尋找新的慢性腎病治療藥物是目前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，中藥在慢性腎病的治療中具有一定的優(yōu)勢(shì)[7]。丹參酮ⅡA (tanshinone ⅡA,TSⅡA) 是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡及抗動(dòng)脈粥樣硬化等活性，常被用于心血管疾病的治療[8-9]。也有研究表明，TSⅡA能減輕急性腎損傷大鼠腎纖維化[10]。但TSⅡA對(duì)Adriam誘導(dǎo)的腎小管系膜細(xì)胞凋亡的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文采用Adriam處理人腎小管系膜細(xì)胞以探究TSⅡA對(duì)腎小管系膜細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RMPI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TSⅡA購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)：110766-201416)；Adriam購(gòu)自西安利君制藥有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：160411)；Annexin-PE試劑盒(貨號(hào)：C1065)、CCK8試劑盒(貨號(hào)：C0038)、BCA試劑盒(貨號(hào)：P0010)購(gòu)自碧云天生物科技技術(shù)研究所，Hoechst 33256染色液(貨號(hào)：C0030)和RIPA裂解液(貨號(hào)：R0010)購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)公司；Caspase-3(貨號(hào)：ABC495)和Caspase-9(貨號(hào)：AB3629)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，二抗購(gòu)自北京博奧森生物科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人腎小球系膜細(xì)胞株HMCL購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。用含有10%胎牛血清、100 U/mL和100 μg/mL的RMPI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HMCL細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。每2天換液1次，細(xì)胞融合率達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及模型復(fù)制

將HMCL細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為HMCL組、Adriamycin組、Adriam+TSⅡA(5 μM) 組、Adriam+TSⅡA(10 μM)組和Adriam+TSⅡA(20 μM) 組，每組6個(gè)復(fù)孔。除HMCL組外，其余組均加入Adriam處理細(xì)胞并使其終濃度為1 μM，Adriam+TSⅡA(5,10,20 μM) 組同時(shí)加入5,10,20 μM的TSⅡA處理細(xì)胞，24 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞接種于96孔板中，密度為1×105個(gè)/mL。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行模型復(fù)制并加入不同濃度的TSⅡA處理細(xì)胞，24 h后根據(jù)CCK8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)(增殖倍數(shù)=細(xì)胞吸光度/0 h HMCL組細(xì)胞吸光度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用TSⅡA處理細(xì)胞后，用胰酶收集細(xì)胞，以1 000 g的轉(zhuǎn)速離心5 min，并用磷酸鹽緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸沉淀，并再次離心，隨后加入195 μL的結(jié)合緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，并加入5 μL的Annexin V-PE室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞用TSⅡA處理后，用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min。固定完成后用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min。隨后加入Hoechst染色液，以覆蓋細(xì)胞為宜，室溫染色30 min后，棄去Hoechst染色液，用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

將用TSⅡA處理后的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗3次，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，并用BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度。用12% SDS-PAGE分離蛋白，用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用脫脂牛奶封閉蛋白質(zhì)2 h。隨后以1∶1 000的濃度加入Caspase-3和Caspase-9一抗，4 ℃封閉過(guò)夜，第2天用緩沖液洗去未結(jié)合一抗，加入二抗，室溫孵育1 h后，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液于暗室曝光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TSⅡA對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

為了探究TSⅡA的最佳用藥濃度，本文采用不同濃度的TSⅡA處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)TSⅡA濃度達(dá)到50 μM及以上時(shí)細(xì)胞活性明顯降至80%以下(圖1)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇5,10,20 μM 3個(gè)濃度進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與HMCL組比較，Adriamycin組細(xì)胞增殖速度顯著降低(P<0.01，圖2)；與Adriamycin組比較，Adriam+TSⅡA(5 μM)組、Adriam+TSⅡA(10 μM)組和Adriam+TSⅡA(20 μM)組細(xì)胞增殖速度明顯升高(P<0.05，P<0.01)，表明TSⅡA能減弱Adriam對(duì)HMCL細(xì)胞增殖的抑制作用(圖2)。

圖1 TSⅡA對(duì)HMCL細(xì)胞活性的影響

*:與HMCL組比較，P<0.01；#:與Adriamycin組比較，P<0.05;△:與Adriamycin組比較，P<0.01

2.2 TSⅡA對(duì)腎小球系膜細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

與HMCL組比較，Adriamycin組細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)；與Adriamycin組比較，Adriam+TSⅡA (5 μM) 組、Adriam+TSⅡA (10 μM) 組和Adriam+TSⅡA (20 μM)組細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)，表明TSⅡA能減弱Adriam誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的作用。

2.3 TSⅡA對(duì)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明，與HMCL組比較，HMCL組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4a)；Adriam+TSⅡA(5 μM) 組、Adriam+TSⅡA(10 μM)組和Adriam+TSⅡA(20 μM) 組細(xì)胞凋亡率均顯著低于Adriamycin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4c)；同時(shí)，Hoechst染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，Adriamycin能顯著升高HMCL細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4b)，TSⅡA(5，10，20 μM) 能明顯減弱Adriam促進(jìn)HMCL細(xì)胞凋亡率升高的作用(P<0.05，圖4d)，表明TSⅡA 能減弱Adriam誘導(dǎo)HMCL細(xì)胞凋亡的作用。

*:與HMCL組比較，P<0.01；△:與Adriamycin組比較，P<0.01

3 討論

丹參是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代常被用于冠心病、心肌缺血及慢性心功能衰竭等心血管疾病的治療[11-12]。TSⅡA是從丹參中提取的一類(lèi)脂溶性成分，也是丹參的主要有效成分之一?，F(xiàn)代研究表明，TSⅡA能通過(guò)抗凋亡、抗炎、抗氧化等發(fā)揮對(duì)心、腎等器官的保護(hù)作用[13]。研究表明，TSⅡA能抑制腎近端小管間質(zhì)纖維化，還能減輕慢性腎損傷大鼠的蛋白尿情況、降低大鼠血清肌酐的水平，從而減緩大鼠的腎損傷進(jìn)程[14-15]，表明TSⅡA具有一定的腎保護(hù)作用。但其對(duì)慢性腎損傷中腎細(xì)胞凋亡的作用還未見(jiàn)報(bào)道。

Adriam是一類(lèi)具有較好療效的化療藥物，但由于其具有較強(qiáng)的副作用而限制了其應(yīng)用。大量研究表明，Adriam的大量使用可造成心、腎等多種器官衰竭，使癌癥患者出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥[15-16]，因此，Adriam常被用于誘導(dǎo)慢性腎病動(dòng)物模型。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球?yàn)V膜的主要組成細(xì)胞，在維持腎小球結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，TSⅡA能抑制Adriam誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18]。TSⅡA還能通過(guò)抑制Adriam誘導(dǎo)的線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化減輕大鼠的心肌損傷[19]。王軍建等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，TSⅡA可通過(guò)影響腎組織Nephrin蛋白和腫瘤壞死因子β1的表達(dá)減輕Adriam誘導(dǎo)的腎損傷，提示TSⅡA具有腎保護(hù)作用。本研究中，我們采用Adriam處理人腎小球系膜細(xì)胞，復(fù)制慢性腎病的體外模型。同時(shí)，本文采用濃度梯度的TSⅡA處理腎小球系膜細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TSⅡA濃度高于50 μM時(shí)對(duì)HMCL細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇5，10，20 μM 3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，Adriam能顯著抑制HMCL細(xì)胞增殖，表明Adriam對(duì)HMCL細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性。TSⅡA能顯著減弱Adriam抑制HMCL增殖的作用，表明TSⅡA能減輕Adriam對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的毒性，從而發(fā)揮腎保護(hù)作用。

a：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；b:Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；c:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果的定量分析；d:Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果的定量分析 *:與HMCL組比較，P<0.01；#:與Adriamycin組比較，P<0.05;△:與Adriamycin組比較，P<0.01

研究表明，腎小球系膜細(xì)胞大量死亡可導(dǎo)致腎小球?yàn)V膜滲透性改變、腎小球水腫及毛細(xì)血管破壞等，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[21]。因此，抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡是治療腎疾病的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，TSⅡA能對(duì)抗病毒引起的腎細(xì)胞的凋亡[22]。Hong等[23]研究發(fā)現(xiàn)，TSⅡA能通過(guò)抑制凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和細(xì)胞色素C的表達(dá)抑制Adriam誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。Caspase-3及其上游Caspase-9是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，凋亡基因可通過(guò)上調(diào)線粒體細(xì)胞色素C的表達(dá)，激活Caspase-9和Caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞DNA降解，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。在本研究中，我們采用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色同時(shí)檢測(cè)了各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，Adriam能明顯促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步表明Adriam具有腎毒性。TSⅡA能顯著降低Adriam處理后HMCL細(xì)胞的凋亡率，表明TSⅡA具有抗腎小球系膜細(xì)胞凋亡的作用。此外，TSⅡA還能顯著減弱Adriam對(duì)HMCL細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的促進(jìn)作用，進(jìn)一步證明TSⅡA具有抗腎小球系膜細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，TSⅡA能減弱Adriam對(duì)腎小球系膜細(xì)胞HMCL增殖的抑制作用，抑制腎小球系膜細(xì)胞HMCL凋亡，并能降低HMCL細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，表明TSⅡA能促進(jìn)病理情況下腎小球系膜細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，提示TSⅡA可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減緩慢性腎病的病理進(jìn)程。本研究首次探究了TSⅡA對(duì)Adriam誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡的作用，但對(duì)于其具體作用機(jī)制還未進(jìn)行探討，因此將在之后的研究中針對(duì)其具體的信號(hào)通路進(jìn)行探究。