宮頸病變患者TWIST與E-Cadherin表達(dá)水平的相關(guān)性分析

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(1.成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 611730；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科；4.成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院病理科)

宮頸癌是一種臨床常見婦科惡性腫瘤，發(fā)病率僅低于乳腺癌，是婦科惡性腫瘤致死的主要原因，自宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(Thinprep Liquid-based Cytology test, TCT)篩檢及人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)檢測技術(shù)應(yīng)用以來，大大提高了宮頸癌前病變及宮頸癌的早期診斷率，及時治療后，病死率得到了有效控制[1-2]。但隨著近年來社會結(jié)構(gòu)和人們生活方式的改變，其發(fā)病率逐漸呈年輕化趨勢，關(guān)于其復(fù)雜發(fā)病機制的研究依舊是目前臨床廣泛關(guān)注的熱點。TWIST蛋白是一種主要在胚胎中胚層及胎盤等組織中表達(dá)的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，胎兒出生后表達(dá)水平顯著降低，在誘導(dǎo)細(xì)胞分化及遷移中具有重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，TWIST是一種在多種惡性腫瘤中高表達(dá)的原癌基因，與腫瘤細(xì)胞凋亡、血管生成及腫瘤抗藥性密切相關(guān)，同時還具有誘導(dǎo)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的作用，學(xué)者認(rèn)為可將其作為惡性腫瘤預(yù)后及治療的新的靶點[3]。E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)是一種參與了Ca2+依賴性細(xì)胞黏附生理過程的跨膜糖蛋白。上皮性腫瘤疾病進展過程中可觀察到不同程度的E-Cadherin丟失或功能抑制，且E-Cadherin可能與腫瘤分化及臨床分期具一定相關(guān)性[4]。截止目前，已在食管鱗癌、乳腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)有TWIST與E-Cadherin的異常表達(dá)[5-6]，然而關(guān)于其在宮頸癌中的研究鮮有報道。本研究通過檢測TWIST與E-Cadherin在宮頸癌中的表達(dá)水平，并結(jié)合宮頸癌臨床病理因素綜合分析，探究其表達(dá)水平的相關(guān)性及其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源①宮頸癌組：收集2014年7月至2017年6月于本院行廣泛性全子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)治療患者的完整宮頸癌標(biāo)本74例，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診宮頸癌?；颊吣挲g30～62歲，平均47.1歲，術(shù)前均未接受放療及化療，排除合并惡性腫瘤、婦科嚴(yán)重感染性疾病及妊娠期患者，半年內(nèi)無子宮頸治療史及子宮內(nèi)膜異位病史。②宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)組：收集同期于本院行Leep手術(shù)切除/陰道下活檢的完整CIN標(biāo)本35例。③正常宮頸組：收集同期與本院因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)治療的正常宮頸組織22例。入組研究的患者術(shù)后病理組織經(jīng)石蠟固定標(biāo)本后，均經(jīng)免疫組化染色處理，由2名經(jīng)驗豐富的病理專家審查后做出統(tǒng)一的病理臨床診斷，并獲取患者年齡、組織類型、臨床分期等臨床資料。

1.2方法

1.2.1 主要實驗試劑 兔抗人TWIST多克隆抗體(北京博奧森生物有限公司)，兔源性二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，SP試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 標(biāo)本處理 常規(guī)組織標(biāo)本取材后，石蠟固定，低溫-20℃保存冷凍10min；連續(xù)切片4張，厚度約為4μm，置于烤箱中烘干后，將切片浸入二甲苯中10min×2次，無水乙醇中2min×2次，90%乙醇中2min×2次，80%乙醇中2min×2次，常規(guī)脫蠟至水化；使用3%過氧化氫孵育15min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗3min；PBS緩沖液(PH7.0)沖洗5min，沖洗3次。用微波爐行抗原修護，高溫高壓160℃煮沸后持續(xù)3min，自然冷卻至室溫，滴加兔源性一抗，4℃冰箱中過夜；室溫下復(fù)溫，PBS沖洗5min，沖洗3次；兔源性二抗，室溫下孵育30min，PBS沖洗5min，沖洗3次。應(yīng)用DAB顯色，顯色時間約4min；蘇木素復(fù)染1min，自來水沖洗15min；浸入80%乙醇中5min×1次，90%乙醇中5min×1次，無水乙醇中5min×1次，無水乙醇中10min×1次，二甲苯10min×3次，依次浸泡脫水，切片風(fēng)干后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 光學(xué)顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃色或黃褐色染色即可判定為TWIST陽性，觀察到細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色即可判定為E-Cadherin陽性。根據(jù)光學(xué)顯微鏡下可觀察到的染色強度將其分為陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性(++)及強陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗；采用Spearman相關(guān)性分析TWIST與E-Cadherin表達(dá)水平之間的關(guān)系。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TWIST在不同類型宮頸組織中的表達(dá)及其與宮頸癌臨床病理的關(guān)系在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的細(xì)胞核內(nèi)TWIST表達(dá)水平較高，細(xì)胞質(zhì)可觀察到少量表達(dá)。TWIST在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率為18.18%、37.14%、72.97%，三組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；TWIST在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于其在正常宮頸、CIN組織中的表達(dá)，TWIST在正常宮頸及CIN組織中的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。TWIST在宮頸癌中的陽性表達(dá)率與患者不同年齡、不同組織類型、不同臨床分期、不同分化程度及不同腫瘤大小間的差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TWIST在宮頸癌間質(zhì)浸潤深度≥1/2的患者宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于宮頸癌間質(zhì)浸潤深度<1/2的患者，TWIST在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。見表2。

表1 TWIST在不同類型宮頸組織中的表達(dá)(例)

與正常宮頸組比較，aP<0.05；與CIN組比較，bP<0.05。

表2 TWIST的表達(dá)與宮頸癌臨床病理的關(guān)系(例)

2.2 E-Cadherin在不同類型宮頸組織中的表達(dá)及其與宮頸癌臨床病理的關(guān)系E-Cadherin在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為77.27%、60.00%、39.19%，三組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與正常宮頸、CIN組相比，E-Cadherin在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著降低，在正常宮頸及CIN組織中的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。E-Cadherin在宮頸癌中的陽性表達(dá)率與患者不同年齡、不同組織類型、不同臨床分期、不同分化程度及不同腫瘤大小間的差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；E-Cadherin在宮頸癌間質(zhì)浸潤深度≥1/2的患者宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于宮頸癌間質(zhì)浸潤深度<1/2的患者，E-Cadherin在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表3 E-Cadherin在不同類型宮頸組織中的表達(dá)(例)

與正常宮頸組比較，aP<0.05；與CIN組比較，bP<0.05。

表4 E-Cadherin在宮頸癌中的表達(dá)與宮頸癌臨床病理的關(guān)系(例)

2.3 TWIST與E-Cadherin表達(dá)水平的相關(guān)性分析Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TWIST與E-Cadherin在宮頸癌組織中表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.511,P<0.05)。見表5。

表5 TWIST與E-Cadherin在宮頸癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性分析(例)

3 討 論

細(xì)胞凋亡是指機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過基因控制細(xì)胞自助死亡的主動生理過程，涉及多種基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等方面作用影響。而細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡失衡是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)病的主要原因，同時亦是惡性腫瘤的基本特征之一[7]。近年來，人們認(rèn)為TWIST是一種具有編碼抗凋亡蛋白及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡作用的原癌基因，其表達(dá)水平上升可導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險增加[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TWIST在正常宮頸及CIN組織中的表達(dá)主要為陰性及弱陽性，在宮頸癌組織中的表達(dá)主要為中度陽性及強陽性，且TWIST在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于其在正常宮頸、CIN組織中的表達(dá)，TWIST在正常宮頸及CIN組織中的陽性表達(dá)率比較無顯著差異。提示CIN雖具有較高的惡性轉(zhuǎn)化可能，但仍處于癌前病變階段，也可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

本研究分析TWIST的表達(dá)與宮頸癌臨床病理的關(guān)系，結(jié)果顯示，TWIST在宮頸癌中的陽性表達(dá)率不受患者年齡、組織類型、臨床分期、分化程度及腫瘤大小影響，而是受宮頸癌間質(zhì)浸潤深度及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響，宮頸癌間質(zhì)浸潤深度≥1/2及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者TWIST陽性表達(dá)率顯著較高。腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移一直是惡性腫瘤臨床治療工作中的難點問題之一，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，是受多種因素共同影響作用的復(fù)雜生物學(xué)進程。研究發(fā)現(xiàn)，TWIST可通過促進侵入性偽足的高表達(dá)，使其發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，幫助腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織[9]。在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，TWIST具有促進VEGF表達(dá)的作用，可促進新生血管生成，增加染色體不穩(wěn)定性，從而起到促進腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的作用[10]。另外，TWIST的表達(dá)還與宮頸癌的預(yù)后效果相關(guān)，宮頸癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年內(nèi)生存率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，其生存率越低[11]。由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為宮頸癌患者預(yù)后不良的主要原因之一，提示可將TWIST的陽性表達(dá)率作為評價宮頸癌患者預(yù)后效果的參考指標(biāo)之一，但本研究中尚未進行生存率方面的比較分析，仍有待進一步深入探究。

E-Cadherin是一種廣泛存在于人與動物上皮細(xì)胞中的單次跨膜鈣依賴性糖蛋白，具有維持上皮細(xì)胞完整性的重要作用。當(dāng)E-Cadherin丟失或功能被抑制時，可導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力降低，增加細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移風(fēng)險?，F(xiàn)有研究中多認(rèn)為E-Cadherin是一種經(jīng)典的腫瘤抑制蛋白，其表達(dá)水平降低與胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-Cadherin在正常宮頸及CIN組織中的表達(dá)主要為中度陽性及強陽性，在宮頸癌組織中的表達(dá)主要為陰性及弱陽性，且TWIST在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于其在正常宮頸、CIN組織中的表達(dá)，TWIST在正常宮頸及CIN組織中的陽性表達(dá)率比較無顯著差異。其原因可能是CIN屬于低級別的上皮內(nèi)瘤變，其細(xì)胞形態(tài)與炎癥性及不典型性細(xì)胞較為相似，且大多數(shù)CIN患者病情可自行消退恢復(fù)正常，不屬于腫瘤性病變[14]，提示E-Cadherin表達(dá)水平降低可能具有促進宮頸癌發(fā)生的作用。另外，本研究結(jié)果也顯示，E-Cadherin在宮頸癌中的陽性表達(dá)率不受患者年齡、組織類型、臨床分期、分化程度及腫瘤大小影響(P>0.05)，而是受宮頸癌間質(zhì)浸潤深度及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響(P<0.05)，宮頸癌間質(zhì)浸潤深度≥1/2及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者E-Cadherin陽性表達(dá)率顯著較低，提示E-Cadherin表達(dá)水平降低可能具有促進宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的作用，且TWIST與E-Cadherin在宮頸癌組織中表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.511,P<0.05)，TWIST陽性表達(dá)組織中的E-Cadherin陽性表達(dá)率顯著低于TWIST陰性表達(dá)組織，且隨著宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，TWIST陽性表達(dá)率逐漸上升，E-Cadherin陽性表達(dá)率逐漸降低，提示TWIST與E-Cadherin在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中二者相互影響，可能具有拮抗作用。其機制可能是TWIST可作用于E-Cadherin啟動因子上的E-boxes序列，抑制E-Cadherin的表達(dá)，從而降低細(xì)胞粘附率，促進膀胱癌等惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移[15]。本研究仍存在一些不足之處，如：尚未進行TWIST與E-Cadherin表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后生存率的分析，有待進一步隨訪。

綜上所述，TWIST在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中表達(dá)水平顯著上升，且與間質(zhì)浸潤深度及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能具有促進宮頸癌發(fā)生及腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的作用，其作用機制可能與TWIST能抑制E-Cadherin的表達(dá)相關(guān)。