長鏈非編碼RNA H19靶向miR-141調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為①

趙雪卉 劉宗印 毛紅妮

(陜西省寶雞市婦幼保健院,寶雞721000)

卵巢癌是全球第二常見的女性惡性腫瘤，也是女性惡性腫瘤中最常見的死亡原因[1]。隨著時代的發(fā)展，盡管手術(shù)和其他治療方式有所改善，但由于卵巢癌診斷較困難，晚期卵巢癌患者的治療效果和預(yù)后很差[2,3]。因此，研究并闡明卵巢癌發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)用于卵巢癌診斷和靶向治療的新型生物標(biāo)志物是目前的主要方向。

長鏈非編碼RNA是近年來在哺乳動物中廣泛存在的調(diào)控因子，非編碼RNA(lncRNA)在多種細(xì)胞的基因調(diào)控中具有重要作用，可以參與細(xì)胞本身的生長周期和增殖調(diào)控[4,5]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)功能和相關(guān)基因表達(dá)的過程中起到促進(jìn)或抑制的作用[6]。lncRNA和其他miRNA不完全相同，經(jīng)過深入研究lncRNA發(fā)現(xiàn)其可以和miRNA相互結(jié)合形成新的復(fù)合物，對下游調(diào)控元件進(jìn)行直接調(diào)控，參與腫瘤細(xì)胞生長過程[7]。

Lai等[8]提出長鏈非編碼RNA和信使RNA之間的相互作用，形成由lncRNA介導(dǎo)的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過共享一個或多個miRNA應(yīng)答元件，參與蛋白質(zhì)編碼過程，調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)情況。同時Shi等[9]證明了在乳腺癌患者體外和體內(nèi)lncRNA和mRNA相互作用的存在，可以直接調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的生長，并可以作為臨床患者的預(yù)后檢測指標(biāo)。據(jù)報(bào)道，lncRNA H19在卵巢癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，可以通過競爭與miR-133和miR-135的結(jié)合來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分化，并可以促進(jìn)細(xì)胞侵襲，減少細(xì)胞凋亡數(shù)目[10]。而miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)也被證明可以抑制ZEB1的表達(dá)并上調(diào)E-鈣黏蛋白，參與腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育過程[11]。

本研究中，通過檢測lncRNA H19和miR-141的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討lncRNA H19和miR-141對下游蛋白的影響作用，通過對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，明確lncRNA H19和miR-141在卵巢癌中可能的作用機(jī)制?？赡転槁殉舶┑脑\治提供一個潛在的新靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床標(biāo)本 收集2016年7月～2017年1月在醫(yī)院手術(shù)切除并且經(jīng)病理檢查確診為卵巢癌的組織50例，同時取癌旁正常卵巢組織50例。離體后放入4%多聚甲醛中固定。全部患者術(shù)前無化療或放療，卵巢癌為原發(fā)病灶并經(jīng)病理科證實(shí)，患者簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞株與主要試劑 人卵巢癌ES-2、COC1和SKOV3細(xì)胞株均購自武漢大學(xué)中心細(xì)胞庫。細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。ZEB1抗體兔單克隆抗體均購自Abcam(ab71286)。Transwell小室購自美國Millipore公司，Matrigel購自美國BD公司。H19、miR-141及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術(shù)有限公司。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購于日本TaKaRa公司。PCR試劑盒購自美國Sigma公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報(bào)告載體由Promega公司合成。

1.2方法

1.2.1qPCR實(shí)驗(yàn) 使用miRNA提取試劑盒進(jìn)行mRNA抽提，實(shí)驗(yàn)過程按照試劑盒使用說明進(jìn)行，抽提之后，使用核酸濃度檢測儀檢測RNA濃度和純度，最后將其濃度稀釋至50 μg/ml，使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒使用說明進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火32 s，循環(huán)50次后檢測其溶解曲線，檢測完成后，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。H19引物序列：5′-GTAGCGTAGCTTGAGCGTAGCGTAG-3′(正向)和5′-CGTGAGCTGAAAAGTCGATGCGATC-3′(反向)。miR-141引物序列：5′-TGCTAGCTGAGTCGAGTT-TCAGCT-3′(正向)和5′-ATGCTAGAAATGTGCAGCTAGCTA-3′(反向)。

1.2.2雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) miR-141-3′UTR WT代表野生型質(zhì)粒載體和質(zhì)粒結(jié)合共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，miR-141-3′UTR MUT代表突變型質(zhì)粒載體和質(zhì)粒結(jié)合共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，同時使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內(nèi)參照，檢測NC組和H19-siRNA組293T細(xì)胞中miR-141的熒光活性相對值。使用Lipofecta-mine2000(Invitrogen)檢測轉(zhuǎn)染效率在孢菌素酶活性的基礎(chǔ)上正?；８鶕?jù)制造商的說明書，通過雙熒光素酶檢測H19對miR-141的表達(dá)活性的調(diào)控能力，明確H19對miR-141熒光活性的調(diào)控情況。

1.2.3Transwell侵襲試驗(yàn) 所有試劑及器材均于冰塊上預(yù)冷處理，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠100 μl，37℃孵育20 min，逐步消化、離心、計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按照2.5×104ml-1用無血清培養(yǎng)基將卵巢癌細(xì)胞稀釋，制成細(xì)胞懸液；按照每孔200 μl的細(xì)胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；孵育24 h后使用甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15 min，使用棉簽去除小室內(nèi)膜上的細(xì)胞，然后于顯微鏡下計(jì)數(shù)，觀察4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將卵巢癌細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度生長到90%時，用200 μl消毒槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測量劃痕的初始距離(0 time)，在恒溫孵箱中孵育36 h和72 h后，測量劃痕的距離，并計(jì)算細(xì)胞的遷移率。細(xì)胞遷移率的計(jì)算公式=[遷移距離D(0 h)-遷移距離D(36 h、72 h)]/遷移距離D(0 h)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 按照說明書配置SDS-PAGE膠，每孔上樣量為30 μl，進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與一抗(ZEB1濃度為1∶1 000)，內(nèi)參GAPDH(濃度1∶2 000)，4℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標(biāo)記物(濃度1∶2 000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，化學(xué)熒光發(fā)光法(ECL)檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(SPSS，Chicago，IL，USA)，使用χ2進(jìn)行表示。t檢驗(yàn)是用于分析組之間的差異統(tǒng)計(jì)。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1lncRNA H19和miR-141在卵巢癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況 qPCR結(jié)果表明：(圖1A)與癌旁正常卵巢組織相比，卵巢癌中H19 mRNA表達(dá)水平明顯較高[(2.25±0.17)vs(1.09±0.07),P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-141在卵巢癌中的表達(dá)水平相對下調(diào)[(3.07±0.07)vs(1.42±0.14),P<0.05]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H19 mRNA在ES-2卵巢癌細(xì)胞株中表達(dá)水平比其他卵巢癌細(xì)胞株高(圖1B)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們挑選ES-2作為進(jìn)一步生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

圖1 H19和miR-141 在卵巢癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of lncRNA H19 and miR-141 in ovarian cancer tissues and cell linesNote: A.Expression of H19 and miR-141 in ovarian cancer;B.Expression of H19 in ovarian cancer cell lines.*.P<0.05.

2.2lncRNA H19和miR-141之間的相互調(diào)控關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)使用生物信息網(wǎng)站預(yù)測工具發(fā)現(xiàn)H19可能與miR-141有相似的結(jié)合位點(diǎn)序列(圖2A)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示(圖2B)：H19可以明顯抑制miR-141的熒光素酶活性，H19-siRNA能與miR-141的3′UTR特異性結(jié)合，影響其表達(dá)水平及活性。

2.3lncRNA H19和miR-141對卵巢癌細(xì)胞遷移行為的影響 為了檢測H19對卵巢癌ES-2細(xì)胞遷移能力的影響，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)： 和NC對照組相比，H19-siRNA組在不同時間點(diǎn)的細(xì)胞遷移比率明顯降低[36 h(20.62±3.07)%vs(57.36±7.06)%，P<0.05;36 h(62.05±8.62)%vs(91.58±11.08)%，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明抑制H19的表達(dá)后可以在一定程度上抑制卵巢癌ES-2細(xì)胞的遷移能力。

2.4lncRNA H19和miR-141對卵巢癌細(xì)胞侵襲行為的影響 為了檢測H19對卵巢癌ES-2細(xì)胞侵襲能力的影響，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)： H19-siRNA組通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為42.08±7.19，明顯少于NC組228.00±21.95，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明抑制H19的表達(dá)后可以在一定程度上抑制卵巢癌ES-2細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 lncRNA H19 和miR-141 之間的相互調(diào)控關(guān)系Fig.2 Mutual regulation between lncRNA H19 and miR-141Note: A.H19 and miR-141 binding sites;B.Double luciferase to detect the correlation between H19 and miR-141.*.P<0.05.

圖3 lncRNA H19對卵巢癌ES-2細(xì)胞株遷移能力的影響Fig.3 Effect of lncRNA H19 on migration of ovarian cancer ES-2 cell lines

圖4 lncRNA H19對卵巢癌ES-2細(xì)胞株遷移能力的影響Fig.4 Effect of lncRNA H19 on migration of ovarian cancer ES-2 cell linesNote: *.P<0.05.

2.5miR-141對lncRNA H19的逆向調(diào)控作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染了H19-siRNA和miR-141-inhibitor后，H19可以抑制miR-141的表達(dá)活性，miR-141可以反向調(diào)控H19的表達(dá)，同時共轉(zhuǎn)染H19和miR-141的模擬物后，可以觀察到H19和miR-141的表達(dá)均出現(xiàn)相應(yīng)的下調(diào)，表明H19和miR-141之間有一定反饋調(diào)節(jié)關(guān)系(圖5)。

2.6lncRNA H19和miR-141可共同調(diào)控ZEB1蛋白的表達(dá) Western blot檢測H19和miR-141對ZEB1蛋白的表達(dá)情況的影響。結(jié)果顯示(圖6)：在H19-siRNA組中ZEB1的表達(dá)水平比NC組的明顯降低[(0.83±0.13)% vs (2.21±0.28)%，P<0.05]，而轉(zhuǎn)染miR-141-inhibitor之后，ZEB1的表達(dá)水平也相應(yīng)下調(diào)[(1.08±0.07)% vs (2.21±0.28)%，P<0.05]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明H19和miR-141的表達(dá)和ZEB1蛋白的激活有關(guān)，間接也證明了H19和miR-141之間相互調(diào)控的反饋關(guān)系。

圖5 H19和miR-141之間的相互調(diào)控關(guān)系Fig.5 Relationship between H19 and miR-141Note: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖6 Western blot檢測H19和miR-141對ZEB1蛋白的影響情況Fig.6 Effect of H19 and miR-141 on ZEB1 protein detected by Western blot

3 討論

一般來說，具有蛋白質(zhì)編碼能力的lncRNA通常在腫瘤組織或細(xì)胞的發(fā)育階段以特異性方式表達(dá)，而lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，其在組織和細(xì)胞的發(fā)育和疾病中起到調(diào)控和監(jiān)視作用，且lncRNA分子可以成為臨床治療中的有效的生物靶點(diǎn)[12,13]。最近越來越多的研究表明，lncRNA可以與mRNA的MREs競爭，從而影響基因靶標(biāo)表達(dá)[14]。然而，lncRNA和miRNA在惡性卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用目前了解甚少，深度探討lncRNA和miRNA之間的相互作用將有助于研究基于miRNA/lncRNA對卵巢癌的診斷和治療。

在本研究中，首先證實(shí)H19在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，miR-141在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，而通過生物信息學(xué)驗(yàn)證H19可以直接調(diào)控miR-141的表達(dá)活性。此外，本實(shí)驗(yàn)還通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明抑制H19的表達(dá)后可以有效抑制卵巢癌的遷移和侵襲能力。這和Zhou等[15]在胃癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，miR-141在幾種人類惡性腫瘤中存在表達(dá)失調(diào)情況，尤其在肝癌中miR-141和miR-29c可以通過直接作用于ITGB1腫瘤抑制因子參與胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)控過程。miR-141表達(dá)失調(diào)是胃癌發(fā)生過程中早期就存在的表現(xiàn)，可用于胃癌患者的早期診斷和治療的生物標(biāo)志物[16]。之前有研究表明，miR-141可以通過靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)及相關(guān)信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，同時干擾卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，影響其凋亡[16]。 Mei等[17]研究表明，miR-141表達(dá)水平在非小細(xì)胞肺癌組織中也明顯上調(diào)，其可以調(diào)控PHLPP1和PHLPP2表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)體外非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和體內(nèi)腫瘤的生長。這可能與miR-141的腫瘤特異性相關(guān)，在部分腫瘤組織類型中可能是起到致癌作用，但在另一種腫瘤組織類型中可能起到抑制腫瘤的作用，這取決于腫瘤的類型和不同性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞。

lncRNA H19具有相對保守的開放閱讀框架，不參與RNA分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，但是具有穩(wěn)定的二級RNA結(jié)構(gòu)，一般在胚胎和胎盤組織中存在水平較高，并且可能在胚胎發(fā)生和胎兒生長中起關(guān)鍵作用[18,19]。最新研究證據(jù)表明，lncRNA H19在許多類型的惡性腫瘤中均存在表達(dá)異常情況，包括肝細(xì)胞癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中存在過表達(dá)情況，但H19參與卵巢癌的潛在作用機(jī)制尚不清楚[20-23]。Zhu等[24]也提出，lncRNA H19及其衍生物可以調(diào)控miR-675的表達(dá)活性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床轉(zhuǎn)移比例呈正相關(guān)關(guān)系，H19可以通過衍生物誘導(dǎo)miR-675的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。在本研究中，通過調(diào)查H19和miR-141在卵巢癌中的表達(dá)和作用，明確H19對卵巢癌ES-2細(xì)胞的促癌作用，抑制H19表達(dá)后ES-2細(xì)胞遷移和侵襲特性明顯降低，而miR-141可以反向調(diào)控H19的表達(dá)活性，共同參與卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控。此外，我們還檢測了H19對miR-141及其靶基因ZEB1水平的作用。結(jié)果顯示H19可與miR-141競爭調(diào)控ZEB1蛋白的表達(dá)，共同影響下游ZEB1的活性，然而本實(shí)驗(yàn)僅僅研究了一種miRNA和lncRNA H19之間的關(guān)系，H19是否和其他miRNA有直接或間接的調(diào)控關(guān)系，是否共同影響卵巢癌的生物學(xué)活動，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，本研究顯示在卵巢癌中l(wèi)ncRNA H19與miR-141之間的相互調(diào)控關(guān)系，表明H19的異常表達(dá)與ZEB1蛋白的激活有密切關(guān)系，共同調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程和卵巢癌細(xì)胞的遷移轉(zhuǎn)移行為。其有可能成為預(yù)測卵巢癌的進(jìn)展、預(yù)后和監(jiān)測治療效果的分子標(biāo)志物。因此，更多的lncRNAs的鑒定將增強(qiáng)對lncRNAs在惡性腫瘤中功能的了解，能夠更好地了解卵巢癌的發(fā)病機(jī)理，促進(jìn)對其早期診斷和治療方向的發(fā)展。