MiR-214靶向線粒體相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子2對T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的調(diào)控作用①

胡 敏 李海龍 符才波 陳 瑜 陳 軍

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，?？?70102)

淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤(Lymphoblastic lympho-ma，LBL)是一種少見的具有高度侵襲性的惡性淋巴瘤，常見于兒童和青少年，是兒童和青少年中第二常見的非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin lymphoma,NHL)亞型[1]。90%的LBL都為T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤(T cell lymphoblastic lymphoma，T-LBL)[2]。T-LBL嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。加深對T-LBL的研究對人類抗癌事業(yè)具有重要意義。大量研究表明惡性淋巴瘤中存在許多表達(dá)異常的小RNAs(microRNAs,miRs)[3,4]。這些microRNAs在淋巴瘤中具有重要的調(diào)控作用[5-7]。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-214在骨髓瘤、黑色素瘤及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種癌癥中，通過靶向下游基因調(diào)控癌細(xì)胞增殖、凋亡、血管新生，侵襲及轉(zhuǎn)移等，具有成為多種癌癥治療靶點(diǎn)的潛能[8,9]。有數(shù)據(jù)表明miR-214在T-LBL中高表達(dá)，miR-214過表達(dá)可作為T-LBL診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記分子[10]。但miR-214在T-LBL中的具體功能的報(bào)道還十分罕見，還有待進(jìn)一步研究。本研究主要目的是探索miR-214對T-LBL細(xì)胞Jurkat增殖、凋亡和侵襲的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑 T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清及轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司。RNA提取試劑盒RNAiso Plus reagent和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自大連TaKaRa公司。熒光素酶報(bào)告載體pGL3來源于Promega公司。CCK-8試劑盒來源于日本同仁化學(xué)公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit，Transwell小室及人工基底膜來源于美國BD公司。Jurkat細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Jurkat細(xì)胞分為4組：Jurkat(對照組)；miR-214 inhibitor組；sh-AIFM2組；miR-214 inhibitor+sh-AIFM2組。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 按照試劑盒說明書提取Jurkat細(xì)胞中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行qRT-PCR。MiR-214上游引物：5′-GGACAGGACGCACAGTCA-3′，miR-214下游引物：5′-CAGACGAGGCTCCGTGGT-3′；AIFM2上游引物：5′-GGCCAGTGTCTGTC-TGTGAG-3′；AIFM2下游引物：5′CGTGTATGGCA-GAGATTTG-3′。用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.2熒光素酶分析 在Jurkat細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-214對照和pGL3空載體作為對照組；轉(zhuǎn)入miR-214對照和含野生型或者突變型AIFM2序列的重組載體；轉(zhuǎn)入miR-214和pGL3空載體或者含野生型或者突變型AIFM2序列的重組載體。培養(yǎng)48 h后移去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞后加入1×的細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解。振蕩器上室溫振蕩5～10 min，移入離心管中離心，3 000 r/min,5 min。取上清進(jìn)行發(fā)光測定。

1.2.3CCK-8檢測細(xì)胞增殖 單獨(dú)或同時(shí)將miR-214 inhibitor和sh-AIFM2轉(zhuǎn)入Jurkat細(xì)胞中，連續(xù)培養(yǎng)4 d，每天檢測細(xì)胞增殖。首先用稀釋到10%的CCK-8溶液，再用上述稀釋液將待測細(xì)胞懸浮，然后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，最后在450 nm處檢測吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 首先用1×的Binding buffer將4組待測的細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細(xì)胞儀對染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.5Transwell檢測細(xì)胞侵襲 首先用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液將4組待測的細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的懸液。然后將上述細(xì)胞懸液加入已鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，并在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液。37℃培養(yǎng)24 h，用0.5%的結(jié)晶紫對上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞除去。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1Jurkat細(xì)胞中miR-214負(fù)向調(diào)控AIFM2表達(dá) 利用qRT-PCR檢測miR-214和AIFM2表達(dá)。圖1顯示，miR-214 mimic增強(qiáng)miR-214表達(dá)的同時(shí)會(huì)抑制AIFM2表達(dá)(P<0.05)。反之，miR-214 inhi-bitor抑制miR-214表達(dá)的同時(shí)會(huì)提高AIFM2表達(dá)(P<0.05)。上述結(jié)果表明，在Jurkat細(xì)胞中miR-214負(fù)向調(diào)控AIFM2表達(dá)。

2.2MiR-214與AIFM2存在直接靶向關(guān)系 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-214可靶向AIFM2，利用熒光素酶進(jìn)一步驗(yàn)證miR-214與AIFM2的靶向關(guān)系。如圖2所示，轉(zhuǎn)染miR-214，或者含野生型AIFM2序列的重組載體，或者含突變型AIFM2序列的重組載體及同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214和含突變型AIFM2序列的重組載體都不會(huì)影響熒光素酶活性。但同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214和含野生型AIFM2序列的重組載體后，熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)。由此可見，miR-214確實(shí)與AIFM2存在直接靶向關(guān)系。

2.3沉默Jurkat細(xì)胞AIFM2表達(dá) 利用shRNA干擾Jurkat細(xì)胞AIFM2表達(dá)，通過qRT-PCR檢測AIFM2表達(dá)分析干擾效果。由圖3可知，在Jurkat細(xì)胞中轉(zhuǎn)入sh-AIFM2后AIFM2相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果說明，sh-AIFM2已成功沉默Jurkat細(xì)胞的AIFM2。

2.4MiR-214靶向AIFM2對Jurkat細(xì)胞增殖的影響 通過CCK-8檢測miR-214 inhibitor結(jié)合sh-AIFM2對Jurkat細(xì)胞增殖的影響。圖4顯示，miR-214 inhibitor可降低細(xì)胞增殖；sh-AIFM2會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞增殖(P<0.05)。而且，sh-AIFM2會(huì)減弱miR-214 inhibitor對細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.05)。上述結(jié)果表明，抑制Jurkat細(xì)胞miR-214可通過AIFM2降低細(xì)胞增殖。

圖1 qRT-PCR檢測miR-214(A)和AIFM2(B)表達(dá)Fig.1 Expression of miR-214(A)and AIFM2(B)was tested by qRT-PCRNote: *.P<0.05 vs.Jurkat(control group).

圖2 熒光素酶分析Fig.2 Luciferase assayNote: *.P<0.05 vs.control group.

2.5MiR-214靶向AIFM2對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響 為分析miR-214對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。如圖5所示，miR-214 inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組；sh-AIFM2組細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組(P<0.05)。與miR-214 inhibitor組相比，miR-214 inhibitor+ sh-AIFM2組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)。由此可見，抑制Jurkat細(xì)胞miR-214可通過AIFM2促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.6MiR-214靶向AIFM2對Jurkat細(xì)胞侵襲的影響 利用Transwell檢測Jurkat細(xì)胞侵襲，分析miR-214對Jurkat細(xì)胞侵襲的影響。由圖6 可知，miR-214 inhibitor組細(xì)胞侵襲明顯低于對照組；sh-AIFM2組細(xì)胞侵襲明顯高于對照組(P<0.05)。而且，sh-AIFM2會(huì)減弱miR-214 inhibitor導(dǎo)致的細(xì)胞侵襲的下降(P<0.05)。以上結(jié)果說明，抑制Jurkat細(xì)胞miR-214可通過AIFM2降低細(xì)胞侵襲。

圖3 qRT-PCR檢測AIFM2表達(dá)Fig.3 Expression of AIFM2 was detected by qRT-PCRNote: *.P<0.05 vs.Jurkat(control group).

圖4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖Fig.4 Cell proliferation was measured by CCK-8Note: *.P<0.05 vs.Jurkat(control group)；#.P<0.05 VS.miR-214 inhibitor group.

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Fig.5 Apoptosis was detected by flow cytometryNote: *.P<0.05 vs.Jurkat(control group)；#.P<0.05 vs.miR-214 inhibitor group.

圖6Transwell檢測細(xì)胞侵襲

Fig.6CellinvasionwasdetectedbyTranswell

Note: *.P<0.05 vs.Jurkat(control group)；#.P<0.05 vs.miR-214 inhibitor group.

3 討論

目前針對LBL的治療策略主要包括強(qiáng)化誘導(dǎo)緩解化療，早期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)防，合并阻斷和隨后的維護(hù)治療等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療受到了越來越多的關(guān)注[2]。大量數(shù)據(jù)表明許多microRNAs在靶向治療中發(fā)揮著積極作用[11-13]。這些microRNAs具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等功能。

細(xì)胞增殖的不受控制是癌細(xì)胞的主要特征之一。大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNAs在細(xì)胞增殖方面具有重要的調(diào)控作用。有研究表明降低miR-155表達(dá)可通過FOXO3抑制NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SNK-6增殖[14]。Li等[15]發(fā)現(xiàn)miR-23a/b可通過直接靶向Fas提高小鼠胸腺淋巴瘤細(xì)胞增殖。有數(shù)據(jù)顯示抑制鼻咽癌細(xì)胞miR-214表達(dá)可通過Bax降低細(xì)胞增殖[16]。據(jù)報(bào)道在卵巢癌中miR-214可通過直接靶向PTEN促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]。本文結(jié)果顯示，在Jurkat細(xì)胞中miR-214負(fù)向調(diào)控AIFM2表達(dá)，而且miR-214與AIFM2存在直接靶向關(guān)系。抑制Jurkat細(xì)胞miR-214可通過AIFM2降低細(xì)胞增殖。

各類癌癥中常常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的異常，許多microRNAs具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。有研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-155可通過SOCS3促進(jìn)淋巴瘤OCI-LY10細(xì)胞凋亡[18]。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-467a可直接靶向FAS和Bax抑制小鼠胸腺淋巴瘤細(xì)胞凋亡[19]。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中miR-214可通過直接靶向PTEN降低細(xì)胞凋亡，發(fā)揮致癌作用。有研究表明在口腔癌細(xì)胞中抑制miR-214可通過靶向RASSF5 促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。類似地，本研究結(jié)果顯示，抑制Jurkat細(xì)胞miR-214可通過AIFM2提高細(xì)胞凋亡。

越來越多的研究表明microRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲方面具有重要作用。據(jù)報(bào)道，抑制彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞miR-21表達(dá)可通過PDCD4 和PTEN導(dǎo)致細(xì)胞侵襲的降低[22]。有數(shù)據(jù)顯示miR-214可通過直接下調(diào)LZTS1表達(dá)提高骨肉瘤細(xì)胞侵襲[23]。Yang等[24]發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor會(huì)降低細(xì)胞侵襲，但下調(diào)PTEN會(huì)減輕miR-214 inhibitor對侵襲的抑制作用。有研究表明miR-214可通過靶向P53促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲[25]。與前人結(jié)果類似，本文結(jié)果顯示，抑制Jurkat細(xì)胞miR-214可通過AIFM2降低細(xì)胞侵襲。

研究表明miR-214在不同的癌癥中可能具有不同的功能。miR-214在口腔癌、胃癌及骨肉瘤等癌癥中發(fā)揮致癌基因的作用[21-24]。但有研究表明miR-214在宮頸癌中通過ARL2發(fā)揮著抑癌基因的作用[26]。這可能與miR-214的靶基因有關(guān)。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-214可通過AIFM2調(diào)控T-LBL細(xì)胞SUP-T1增殖和凋亡，而對T-LBL細(xì)胞侵襲的影響還未見報(bào)道[27]。本研究表明，在Jurkat細(xì)胞中，miR-214靶向AIFM2不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，還可以調(diào)控細(xì)胞侵襲。下一步計(jì)劃運(yùn)用動(dòng)物模型研究miR-214在T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤中的作用。