MIB2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的影響①

徐 哲 劉 健 沈少靈 偏麗麗 黃曉峰 林 周 修冰水

(安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥230000)

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是比較常見的惡性腫瘤，其高發(fā)病率和高致死率一直是人類難以解決的問題之一，在中國(guó)每年有超過(guò)三十萬(wàn)人死于HCC，其致死率在腫瘤相關(guān)死亡病例中位于第二位，僅次于肺癌，嚴(yán)重危害了人類的生活質(zhì)量和生命健康[1]。肝癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，其具體分子機(jī)制尚不清楚[2]。多項(xiàng)研究表明炎癥和RNA病毒(如HCV)感染是肝癌發(fā)病的關(guān)鍵因素[3,4]。炎性細(xì)胞因子TNF-α在體內(nèi)外均可直接殺傷腫瘤細(xì)胞。另有研究顯示自分泌的IL-6會(huì)促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5-8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用手術(shù)、放療、化療、血管介入治療等方法，但療效并不理想，年生存率僅8%～10%[9，10]。因此研究其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋求一種新的治療方式有著深遠(yuǎn)的意義。

Mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 2(MIB2)是Notch配體Delta的E3泛素連接酶[11-13]。近年來(lái)越來(lái)越多證據(jù)證明，Notch 信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[14-18]。而MIB2在腫瘤中的作用尚不清楚[19]。本研究通過(guò)建立過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株，以TNF-α和SEV作用于肝癌細(xì)胞，采用軟瓊脂克隆形成、免疫印跡法及ELISA等方法檢測(cè)MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞的影響，并探討其可能機(jī)制。運(yùn)用過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株及瞬時(shí)敲低MIB2探究對(duì)炎癥因子IL-6所產(chǎn)生的影響，從而為肝癌的后期治療提供新的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，進(jìn)而為臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；RIPA裂解液及蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTMRNA iMaX Reagent敲低試劑盒和Hygromycin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Notch1抗體和MIB2抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；山羊抗鼠β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；ECL發(fā)光液、人IL-6(hIL-6)/人TNF-α(hTNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；X光片、顯影液、定影液購(gòu)自美國(guó)Kodak公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；Agar購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RNA病毒Sendi virus(SEV)為北京大學(xué)蔣爭(zhēng)凡教授惠贈(zèng)；FLAG-MIB2質(zhì)粒由Addgene公司提供；小鼠TNF-α(mTNF-α)購(gòu)自R&D公司。

1.1.2儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱與低溫高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan sunrise公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SDS-PAGE蛋白電泳及轉(zhuǎn)印購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞HepG2為本實(shí)驗(yàn)室保種存放。由含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/ml 青霉素鈉和100 U/ml 硫酸鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，0.25%胰酶消化、計(jì)數(shù)、傳代。

1.2.2篩選過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株 細(xì)胞轉(zhuǎn)染FLAG-MIB2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后按100、1 000、10 000個(gè)細(xì)胞/孔的比例種入96孔板，同時(shí)按40 μg/ml的濃度加入Hygromycin篩選過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株，兩周后，挑選單克隆移入24孔板，長(zhǎng)滿后種入6孔板并鑒定，選擇鑒定成功的MIB2穩(wěn)定株傳代，并凍存于液氮用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3軟瓊脂克隆形成 按照 4.5 ml∶4.5 ml∶1 ml的體積依次將2×DMEM、1.2% Agar和血清混合，制備下層凝膠。整個(gè)過(guò)程避免氣泡產(chǎn)生，需快速充分混勻后加入6孔板中(如不快速混勻，易發(fā)生凝固現(xiàn)象)。每孔1.5 ml，晃動(dòng)使其均勻鋪展，置于4℃促凝20 min。促凝期間取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整其密度至104ml-1待用。最終細(xì)胞數(shù)量定在103孔-1。細(xì)胞懸液制備完畢后，按照1 400 μl∶350 μl∶350 μl∶1 400 μl的體積依次將2×DMEM、血清、單細(xì)胞懸液和0.6%凝膠液混合，制備上層凝膠。整個(gè)過(guò)程同樣避免氣泡產(chǎn)生，快速充分混勻后每孔1 ml，加入6孔板下層凝膠之上，輕柔晃動(dòng)使其均勻鋪展，置于4℃促凝10 min。待上層凝膠充分凝固之后，每孔加入1 ml 1×完全DMEM培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，14 d后將培養(yǎng)基棄掉，每孔加入1 ml MTT，4 h后觀察集落形成情況。

1.2.4Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 使用(mTNF-α)和SEV處理6孔板內(nèi)生長(zhǎng)良好的MIB2過(guò)表達(dá)HepG2細(xì)胞和陰性對(duì)照4 h，設(shè)置未處理組、TNF-α組、SEV組，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。用預(yù)冷的生理鹽水洗滌后，每孔加入120 μl RIPA裂解液，刮取細(xì)胞收集于1.5 ml EP管內(nèi)，冰上裂解15 min，4℃離心機(jī)13 000 r/min離心15 min，利用紫外分光光度計(jì)調(diào)整蛋白濃度，沸水煮10 min使蛋白充分變性。SDS-PAGE電泳，60 V恒壓轉(zhuǎn)印3 h到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，孵育一抗(β-actin、FLAG、MIB2、Notch1)4℃過(guò)夜，次日TBST洗3遍，每次10 min，HRP山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，TBST洗3遍，每次10 min，涂ECL后于暗室曝光顯影。

1.2.5ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子 將生長(zhǎng)良好的MIB2過(guò)表達(dá)HepG2細(xì)胞和陰性對(duì)照用0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)后，以每孔 2×105細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中待貼壁完成后，分別設(shè)置未處理組、TNF-α組、SEV組，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。4 h之后將細(xì)胞上清收取凍存于-80℃冰箱，用于ELISA檢測(cè)。按照ELISA試劑盒說(shuō)明操作，在酶標(biāo)儀450 nm及570 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度，并測(cè)定其ODA450nm及ODA570nm值，使用Prism軟件分析計(jì)算。

1.2.6小干擾RNA(siRNA)敲低MIB2 以每孔2×105細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，待貼壁培養(yǎng)20 h后，按照說(shuō)明書，利用LipofectamineTMRNA iMaX Reagent轉(zhuǎn)染siRNAs。MIB2 siRNAs序列為：siRNA-1#GGAGGTGCCAAACATCGAT與siRNA-2#GCTAGCTGTGA-GAAAGATT，以非靶點(diǎn)對(duì)照siRNA(NC siRNA)為對(duì)照。48 h 后用于ELISA檢測(cè)或Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1篩選過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株及Western blot鑒定 在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FLAG-MIB2質(zhì)粒并篩選，抗性克隆出現(xiàn)后，利用Western blot方法進(jìn)行鑒定。綜合內(nèi)參、MIB2 以及標(biāo)簽FLAG的蛋白表達(dá)量來(lái)看，我們認(rèn)為第1個(gè)為成功的過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株；3，5，6號(hào)克隆外源MIB2表達(dá)量較低，未能被敏感度偏低的FLAG標(biāo)簽抗體識(shí)別；而4號(hào)克隆可視為陰性對(duì)照。結(jié)果見圖1。選擇1號(hào)過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2過(guò)表達(dá)MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞軟瓊脂克隆形成的影響 陰性對(duì)照與過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株在種入Agar瓊脂14 d后用MTT染色4 h可以觀察到，6孔板中皆有集落形成，其肉眼克隆個(gè)數(shù)見圖2。統(tǒng)計(jì)分析后，可以很明顯的看到過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株的集落形成數(shù)量明顯低于陰性對(duì)照(P<0.01)。

2.3過(guò)表達(dá)MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞Notch1蛋白水平的影響 在陰性對(duì)照與過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株中分別加入小鼠TNF-α，RNA病毒SEV處理4 h，設(shè)未處理組。Western blot檢測(cè)MIB2及FLAG標(biāo)簽，以確定細(xì)胞為過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株，檢測(cè)Notch1的表達(dá)水平，圖3顯示Notch1的表達(dá)水平變化不顯著。

2.4過(guò)表達(dá)MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞分泌IL-6的影響 分別在對(duì)照克隆與過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株中加入小鼠TNF-α，SEV處理4 h，設(shè)未處理組。取上清ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)處理，過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株相對(duì)于對(duì)照克隆而言，人IL-6的分泌均顯著下降，結(jié)果見圖4。在上述各條件下均未檢測(cè)到人TNF-α的分泌。

圖1 過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株的鑒定Fig.1 Identification of stable clones over-express-ing MIB2

2.5小干擾RNA敲低MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞分泌IL-6的影響 為了反向驗(yàn)證這一效應(yīng)，在HepG2細(xì)胞中使用小干擾RNA(siRNA) 轉(zhuǎn)染進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)，首先通過(guò)Western blot驗(yàn)證MIB2已被敲低，結(jié)果見圖5。收集其細(xì)胞上清經(jīng)ELISA檢測(cè)，顯示敲低MIB2后，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)處理，IL-6的表達(dá)均顯著增高，見圖6。因此我們認(rèn)為MIB2對(duì)IL-6的分泌有一定的抑制作用。

圖2 過(guò)表達(dá)MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞軟瓊脂克隆形成的影響Fig.2 Effect of MIB2 over-expression on anchorage-independent growth of HepG2 cellsNote:

圖3 過(guò)表達(dá)MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞Notch1蛋白水平的影響Fig.3 Effect of MIB2 over-expression on protein level of Notch1 in HepG2 cellsNote: Lanes 1-3.Mock:Control，TNF-α，SEV，respectively.Lanes 4-6.FLAG-MIB2:Control，TNF-α，SEV，respectively.

圖4 過(guò)表達(dá)MIB2對(duì)HepG2細(xì)胞分泌IL-6的影響Fig.4 Effect of MIB2 over-expression on secretion of IL-6 in HepG2 cellsNote:

圖5 HepG2肝癌細(xì)胞敲低MIB2的鑒定Fig.5 Identification of MIB2 knockdown in HepG2 cellsNote: Lanes 1-3.NC siRNA:Control，TNF-α，SEV，respectively；Lanes 4-6.MIB2 siRNA-1#，Control，TNF-α，SEV，respectively；Lanes 7-9.MIB2 siRNA-2#.Control，TNF-α，SEV，respectively.

圖6 敲低MIB2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞分泌IL-6的影響Fig.6 Effect of MIB2 knockdown on secretion of IL-6 in HepG2 cellsNote:

3 討論

肝癌是一種常見的、預(yù)后差、具有高度致死性的惡性腫瘤，且發(fā)病率在逐年攀升，嚴(yán)重威脅著人類的生活與健康[20]。已知MIB2為Notch通路的重要調(diào)節(jié)因子，但其在腫瘤中的作用還不清楚[21，22]。通過(guò)探討MIB2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的影響，希望為肝癌的防治提供一種新的理論依據(jù)。

在HepG2肝癌細(xì)胞中篩選過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供更好的研究對(duì)象，經(jīng)軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)觀察集落形成情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MIB2穩(wěn)定株與陰性對(duì)照相比，克隆形成能力明顯降低(P<0.01)，表明了MIB2在HepG2肝癌細(xì)胞中有一定的抑制作用。與預(yù)期不一致的是，MIB2過(guò)表達(dá)并沒有影響Notch1的表達(dá)水平，所以MIB2不是通過(guò)調(diào)控Notch通路活性影響HepG2細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道HepG2自分泌IL-6，而自分泌的IL-6會(huì)促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5-8]。為了探討可能的機(jī)制，本研究分析了MIB2對(duì)IL-6表達(dá)分泌的影響。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MIB2導(dǎo)致HepG2細(xì)胞IL-6本底水平的分泌和TNF-α及SEV誘導(dǎo)的分泌均下降，而MIB2敲低后，HepG2細(xì)胞IL-6本底水平的分泌和TNF-α及SEV誘導(dǎo)的分泌均增強(qiáng)，反向驗(yàn)證上述效應(yīng)。

本研究提示MIB2參與了肝癌惡性生長(zhǎng)的調(diào)控。然而，MIB2在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中扮演著怎樣的角色，還需后期的大量實(shí)驗(yàn)研究去揭示。如果使用 MIB2 激動(dòng)劑，可能會(huì)抑制IL-6的自分泌，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)，但目前市場(chǎng)上尚無(wú)成品 MIB2 激動(dòng)劑出售[23]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和不斷進(jìn)步，將來(lái)可能會(huì)有MIB2 激動(dòng)劑出現(xiàn)，可能用于臨床肝癌的治療。