超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法定性篩查保健食品中西地那非及其相關功效類非法添加化合物

于 泓, 胡 青, 孫 健, 馮 睿, 張 甦, 張靜嫻, 毛秀紅, 季 申

(上海市食品藥品檢驗所, 上海 201203)

勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)為發(fā)病率較高的疾病之一,因此抗ED藥物有著龐大的市場[1]。近年來,針對此類疾病而生產的補腎壯陽、抗疲勞類保健食品數(shù)量不斷攀升。而違禁添加抗ED藥物現(xiàn)象亦屢禁不絕,其中以添加西地那非為代表的磷酸二酯酶5抑制劑(phosphodiesterase-5, PDE-5)類的化合物最為常見,另外亦存在違禁添加育賓亨、達泊西汀等化合物的情況[2]。上海食品藥品檢驗所在2016年3月～2018年3月期間對 1 414 批可能存在添加西地那非及其相關功效類化合物的食品、保健品進行檢測,其中458批樣品中存在非法添加化學藥物現(xiàn)象。此類非法添加行為的添加劑量及種類隨意,消費者在不知情的情況下長期或過量服用可能對健康和生命安全造成嚴重危害[2-3]。

目前,我國相關標檢測標準共5項:國家藥品補充檢驗方法和檢驗項目批準件2009030、食藥監(jiān)食監(jiān)三[2016]28號文附件7和國家食品補充檢驗方法BJS201601、BJS201704、BJS201710。共計覆蓋檢測PDE-5抑制劑類化合物13種。但不法商販為規(guī)避監(jiān)管,不擇手段地尋找新型添加物以牟取暴利,僅國內報道的新型PDE-5抑制劑,如丙氧苯基西地那非、丙氧基艾地那非、丙氧苯基硫代艾地那非、羥基硫代豪莫西地那非、丙氧苯基硫代羥基豪莫西地那非、2-羥乙基去甲基他達拉非等就有數(shù)十種[4-8]。在北美、歐洲、日韓等地發(fā)現(xiàn)被非法添加入食品及保健品的西地那非及其相關功效類的化合物還有:卡波地那非、西地那非N-氧化物、他達拉非甲基氯化物、去甲基卡巴地那非等近80種[2,9-12]。因此,現(xiàn)行標準難以有效打擊非法添加新型衍生物的行為,亟須更為準確高效、專屬性強、覆蓋范圍廣的國家標準以支撐目前市場監(jiān)管需求。美國藥典(USP)通則〈2251〉是目前國際上較為明確的針對非法添加檢測的標準。其通則附錄A中共列出64種性功能類化合物的6種定性檢測方法[13]。

超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質譜法具有準確可靠、靈敏快速、通量高等特點,被廣泛應用于國內外的非法添加檢測領域[2,14-22]。而離子全通過的檢測模式可以實現(xiàn)非靶標(nontarget)檢測[19];通過誘導碰撞解離(collision induced dissociation, CID)可以獲得碎片離子的精確相對分子質量信息,定性準確，有利于跨類別添加物及未知新型類似物的發(fā)現(xiàn),亦可根據(jù)精確碎片信息發(fā)現(xiàn)并解析未知化合物,非常適用于非法添加類的檢測。

本實驗采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿-飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF-MS),研究建立了102種抗ED藥物高分辨質譜的定性篩查檢測方法,包括98種PDE-5抑制劑,及育亨賓等其他4種具抗ED功效的化合物。該方法快速、準確、通量高,可根據(jù)保留時間、母離子及碎片離子的精確相對分子質量準確定性,并且覆蓋化合物范圍較廣,驗證基質更加全面。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity高效液相色譜儀,Agilent 6530 Q-TOF質譜儀(美國Agilent公司), Sartorius CP225D分析天平(德國Sartorius公司),超聲儀(上?？茖С晝x器有限公司)。甲醇、鹽酸和乙酸乙酯為分析純試劑(上海凌峰化學試劑有限公司);質譜用水和乙腈為LC-MS級試劑,甲酸為色譜純試劑，均為德國Merck公司提供;質譜所用參比液、調諧液均為美國Agilent公司提供。

對照品來源及相關信息詳見表1,對照品純度均≥98% 。樣品購自市場。

1.2 分析條件

Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(75 mm×3.0 mm, 2.7 μm);柱溫:30 ℃;進樣體積:1 μL;流速:0.4 mL/min;流動相:A為0.1%(v/v)的甲酸水溶液,B為乙腈。洗脫梯度:0～15 min, 5%B～95%B; 15～17 min, 2%B;后運行時間3 min。

離子源:電噴霧離子(electrospray ionization,ESI)源;掃描方式:正離子模式;毛細管電壓:正離子模式 5 000 V;離子源溫度:325 ℃;干燥氣流量:12 L/min;霧化氣壓力:345 kPa;鞘氣溫度:375 ℃;鞘氣(N2)流量:12 L/min。

將102種化合物的名稱、分子式、CAS號、精確相對分子質量、結構圖等信息導入MassHunter PCDL Manager軟件(美國Agilent公司)譜庫。用已建立的液相色譜及質譜方法采集對照品數(shù)據(jù),將保留時間輸入譜庫。分別對各化合物[M+H]+峰進行誘導碰撞能量的優(yōu)化,得到各化合物的二級碎片離子信息,再將采集的二級數(shù)據(jù)通過軟件計算進行標準化后導入譜庫。所建立標準譜庫中各化合物二級碎片均為理論值。各化合物主要二級碎片(m/z)見表1。

1.3 標準溶液的配制

分別取上述標準品適量,精密稱定,用甲醇溶解并配制質量濃度為200 μg/L 的標準品儲備溶液(如不能溶解完全,可滴加1滴鹽酸),分別取標準品儲備液適量混合,作為標準品混合溶液,供檢測用。

1.4 樣品前處理

固態(tài)或半固態(tài)試樣:取適量混勻,研細,稱取0.50 g于50 mL具塞離心管中,加入甲醇25 mL,密塞,超聲提取10 min,放冷,用0.22 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液,根據(jù)實際濃度適當稀釋,備用。

液態(tài)試樣:取適量搖勻,吸取0.5 mL于50 mL具塞離心管中,加甲醇至25 mL,密塞,超聲提取10 min,放冷,用0.22 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液,根據(jù)實際濃度適當稀釋,備用。

軟膠囊試樣(油性基質):取內容物適量,混勻,稱取0.50 g于50 mL具塞離心管中,加乙酸乙酯5 mL,振搖,使其分散,再加甲醇至25 mL,密塞,超聲提取10 min,放冷,用0.22 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液,根據(jù)實際濃度適當稀釋,備用。

2 結果與討論

2.1 流動相條件的優(yōu)化

比較了0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、10 mmol/L 甲酸銨水溶液-乙腈兩種流動相體系對目標化合物分離效果的影響。結果表明,以含0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈為流動相時,各待測化合物響應好,靈敏度高,離子化效率最佳。

采用梯度洗脫,為盡量去除極性基質干擾,流動相起始梯度為5%乙腈,PDE-5抑制劑出峰時間集中在2.7～12.4 min,分析時間20 min。

2.2 樣品前處理方法的考察

考慮大部分PDE-5抑制劑類化合物在甲醇中溶解性較好,故采用甲醇作為提取溶劑。比較了乙腈的提取效果,與甲醇提取結果基本一致,綜合考慮成本、試劑毒性等因素,最終確定甲醇作為提取試劑。含油脂類成分較高的基質,如油性基質的軟膠囊,先加少量乙酸乙酯,振搖,使分散,再加甲醇超聲提取。

比較超聲時間,確定超聲10 min即可基本提取完全待測化合物。在實際樣品測定中,宜根據(jù)樣品添加量的實際濃度,進行適當?shù)南♂尯筮M樣,避免進樣濃度過高,污染儀器。另外,復雜的基質如咖啡和中成藥等,適當稀釋后進樣,可有效降低基質效應的影響。

2.3 定性結果判定方法

根據(jù)已建立的標準譜庫進行檢索分析。提取供試品溶液中的化合物信息與標準譜庫比較,設置提取質量窗口為20 ppm(20×10-6),保留時間漂移小于0.5 min。

樣品中檢出的化合物需通過精確相對分子質量(<5 ppm)、保留時間(<0.2 min)、母離子及碎片離子的精確相對分子質量(<5 ppm)與標準譜庫匹配。

圖 1 西地那非及其衍生物的主要碎片離子裂解機制Fig. 1 Proposed fragmentation mechanism of sildenafil and its analogues R1-R4, X and Y: substituents.

2.4 PDE-5抑制劑類特征碎片的歸屬

PDE-5抑制劑類化合物在實際樣品檢測中的檢出頻率最高,按結構主要分為3類:西地那非、伐地那非和他達拉非類。新型衍生物是那非及相關功效類化合物檢出的難點。為迅速識別、判斷樣品是否添加了PDE-5抑制劑類成分,本研究對3類結構類型的化合物碎片進行了分類分析。102種化合物所屬類別詳見表1。通過Molecular Structure Correlator(美國Agilent公司)軟件計算各碎片的可能結構,結合各類別化合物結構特點,推測得到各類別化合物質譜裂解機制,并列出各類別的常見碎片及其結構。圖1～3分別為3種結構類型化合物的共同母核特征及推測的主要碎片結構。表2為不同亞型的代表化合物的特征碎片及歸屬。

2.4.1西地那非及其衍生物

本研究中西地那非類化合物共61種,根據(jù)其X及Y取代基不同又可分為6個不同亞型:西地那非類(Ss)、硫代西地那非類(Sst)、紅地那非類(Sa)、carbodenafil類(Sc)、dithiocarbodenafil類(Scd)和其他類(So)。各亞型化合物特征碎片與結構息息相關,通過分析各西地那非衍生物碎片信息,將常見共同碎片歸類總結,并推測其結構如圖1所示[5,23]。由于化合物取代基不同(尤其Y取代基),質譜行為略有差異,但通常同一亞型的裂解行為相似度極高,實例詳見表2。另外,西地那非類化合物一般在m/z150以下碎片豐度較高,其中包含取代基R3的碎片信息。

2.4.2伐地那非及其衍生物

伐地那非及其衍生物與西地那非類結構較為接近。本研究中共涉及12種,可分為3個不同亞型:伐地那非類(Vv)、硫代伐地那非類(Vvt)和acetylvardenafil類(Va)。裂解規(guī)律與西地那非類似,如 圖2所示。V6碎片相同裂解機制同樣存在于西地那非類衍生物中,但非主要裂解碎片故未列出;由于母核中氮原子位置不同,碎片V5與碎片S5差異明顯,因此為兩類衍生物區(qū)分的關鍵信息,實例詳見表2。而相同碰撞能量下,伐地那非類化合物m/z150以下區(qū)域碎片豐度及數(shù)量通常弱于西地那非類。

圖 2 伐地那非及其衍生物的主要碎片離子裂解機制Fig. 2 Proposed fragmentation mechanism of vardenafil and its analogues

圖 3 他達拉非及其衍生物的主要碎片離子裂解機制Fig. 3 Proposed fragmentation mechanism of tadalafil and its analogues

2.4.3他達拉非及其衍生物

他達拉非及其衍生物根據(jù)母核可分為兩類:有哌嗪二酮環(huán)(Tt)及沒有哌嗪二酮環(huán)(To)。此類化合物與西地那非和伐地那非類結構差異較大,主要特征碎片離子如圖3所示,其中T1和T2為兩類化合物共有主要碎片。實例詳見表2。

2.5 方法學驗證

2.5.1樣品基質影響的考察

根據(jù)市場上常見的補腎壯陽、抗疲勞類產品,選擇了瑪卡片、功能型飲料、軟膠囊、半固體能量膠、蛋白粉、含中藥成分膠囊,餅干、糖果、保健酒、咖啡共10種作為代表性基質。研究發(fā)現(xiàn),在中藥成分膠囊和咖啡中,由于基質效應影響較大,導致多個化合物的檢出限較其他基質偏高,但仍遠低于一般的非法添加檢出劑量,檢出限能夠滿足檢測要求,詳見2.5.3節(jié)。

2.5.2專屬性試驗

上述10種基質按1.4節(jié)中所述方法進行前處理,經(jīng)測試上述10種基質中均不含本標準中102種化合物,對方法無干擾。

2.5.3檢出限試驗

如表3所示，為考察上述100種(化合物49和100在溶液中非常不穩(wěn)定,未做檢出限試驗,詳見2.5.5節(jié))化合物在10種基質中的準確檢出限(LOD),參考GB/T 27417-2017化學分析方法確認和驗證指南中要求,采用目視評價法,以真實最低檢出濃度作為LOD。即分別在各基質中加樣,加樣濃度逐級遞減,至恰好能滿足2.3節(jié)中所述定性檢出要求的含量作為LOD,結果100種化合物的檢出限在0.1～50 mg/kg 或0.1～50 mg/L 之間。

表 2 各亞型典型化合物的主要特征碎片

R1-R4, X and Y: substituents shown in Fig. 1-3; S1-S5: corresponding structures shown in Fig. 1; V1-V5: corresponding structures shown in Fig. 2; T1, T2, To3, To4, Tt3and Tt4: corresponding structures shown in Fig. 3.

表 3 100種化合物在10種基質中的檢出限(n=7)

表 3 (續(xù))

Nos. are the same as in Table 1.

從結果可知,絕大多數(shù)化合物的檢出限低于50 mg/kg 或50 mg/L。極少數(shù)化合物的檢出限稍高,與其化學結構相關,包括含他達拉非及其衍生物、二聚結構和硫代結構普遍稍高,原因為這幾類結構不易離子化;另與基質也相關,膠囊劑和咖啡等基質普遍較高,該類基質復雜,基質效應嚴重,導致檢出限稍高。

臨床中,西地那非、他達拉非推薦使用劑量分別為50 mg/次[24]和5～25 mg/次[25]。假設每次服用保健食品以1 g計,非法添加的含量水平分別為50 g/kg 和5～25 g/kg,本方法的檢出限為0.1～50 mg/kg 之間,即使對于多種化合物混合添加或大口服劑量(添加濃度較低)的樣品,亦可完全滿足非法添加劑量檢測的監(jiān)管需求。

2.5.4重復性試驗

在檢出限水平加樣進行重復性試驗,10種基質一式7份,均檢出100種化合物。(化合物49和100在溶液中非常不穩(wěn)定,未做重復性試驗,詳見2.5.5節(jié)。)

2.5.5穩(wěn)定性

取瑪卡片基質的檢出限加樣溶液,分別在1、4、12、24、48 h進樣,上述100種對照品在48 h內均可檢出,穩(wěn)定性良好。

另兩種化合物sildenafil chlorosulfonyl (No. 49)和tadalafiloxo impurity (No. 100)在溶液中即使放置在-20 ℃保存,穩(wěn)定性也極差,故未列入方法學考察中。且目前國內外均未有檢出上述兩種化合物的報道,本文僅將其化合物信息及碎片離子列出作為參考。

2.6 實際樣品的測定

用本方法在2016年3月～2018年3月期間對 1 414 批市售樣品以及某涉案專項樣品進行檢測,在共計458批樣品中發(fā)現(xiàn)非法添加行為;共檢出西地那非及相關功效化合物19種,總檢出次數(shù)464次(見表4)。并有29批次樣品同時添加多種化合物,其中14批樣品存在同時添加其他功效類別情況,如添加對乙酰氨基、布洛芬、利多卡因等。另外發(fā)現(xiàn)2個化合物疑似新型PDE-5抑制劑衍生物,按照2.5節(jié)進行碎片歸屬。確認其中一個為sildenafil impurity 12 (No. 102),并將其納入本方法;另一化合物的精確相對分子質量為 419.148 1,推測結構式為C23H21N3O5,疑似氨基他達拉非的衍生物,正在進行結構確證工作。

Nos. are the same as in Table 1.

3 結論

本研究針對代表性的食品(含保健食品)基質,建立了超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜定性篩查102種西地那非及其相關功效類非法添加化合物的方法。該方法操作簡便、靈敏、準確,為目前國際上檢測化合物覆蓋面較廣的非法添加物質檢測方法,即將轉化為國家食品補充檢驗方法作為檢測標準進行廣泛應用。

本文旨在通過高分辨質譜的定性篩查,及時、有效地發(fā)現(xiàn)市場中的非法添加行為及新的添加趨勢動態(tài)。該方法既可以作為非法添加檢測初篩的廣譜篩查方法;又可作為低分辨質譜可疑檢測結果的確證方法使用。目前,該方法已多次用于市局及公安委托的涉案應急檢測,可實現(xiàn)廣譜篩查,有效服務監(jiān)管,為打擊非法添加、保障食藥安全提供了有力的技術支持。