細(xì)胞因子預(yù)處理對體外擴增NK細(xì)胞活性的影響*

申重陽，幸倚帆，譚小虎，陳勇軍

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都康景生物科技有限公司，四川 成都 611130）

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell, NK）是機體重要的免疫細(xì)胞，約占外周血單個核細(xì)胞總數(shù)的10%～20%，主要分布在外周血、淋巴結(jié)、脾、骨髓中，可以通過多種趨化因子作用遷移到炎癥部位。NK細(xì)胞可以不依賴于樹突狀細(xì)胞的抗原遞呈作用，清除MHC-I分子陰性的腫瘤細(xì)胞以及被病毒感染的細(xì)胞。因此NK細(xì)胞逐漸成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的熱點，用于控制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[1]。然而由于缺乏有效的NK細(xì)胞體外擴增手段，影響NK細(xì)胞在腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療中的治療效果。因此，應(yīng)用更加有效的方法提高NK細(xì)胞的數(shù)量及活性是臨床急需解決的問題。

目前常用的NK細(xì)胞體外擴增方式為使用多種細(xì)胞因子的聯(lián)合刺激。白細(xì)胞介素（interleukin, IL）IL-2+IL-15的聯(lián)合刺激是體外擴增NK細(xì)胞的常用方案，IL-15可以維持NK細(xì)胞的分化和擴增，抵抗IL-2介導(dǎo)的NK細(xì)胞凋亡[2-3]。IL-2可以促進(jìn)NK前體細(xì)胞和NK成熟細(xì)胞的生長，增加NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞溶解酶的表達(dá)量，增強NK細(xì)胞毒性[4]。此外，IL-12和IL-18也常用于NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)。不同于IL-2和IL-15，IL-12通過促進(jìn)NK細(xì)胞釋放干擾素γ（interferon gamma, IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α），從而達(dá)到抑制腫瘤血管新生以及通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）和細(xì)胞凋亡因子配體（fas ligand, FasL）介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果[5]；IL-18能夠通過上調(diào)NK細(xì)胞表面IL-12受體（IL-12 receptor, IL-12R）的表達(dá)，增強IL-12效果[6-7]。然而如何優(yōu)化細(xì)胞因子組合方式、添加時間點進(jìn)而使得NK細(xì)胞的體外擴增達(dá)到最佳效果，現(xiàn)有的研究并沒有一致的結(jié)論[8-10]。本研究選取IL-2、IL-12、IL-15和IL-184種細(xì)胞因子的3種不同組合和添加方式，對健康志愿者或腫瘤患者的外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）進(jìn)行體外培養(yǎng)，并分析所得NK細(xì)胞的擴增倍數(shù)、細(xì)胞表型以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，以找到一種最有效的NK細(xì)胞體外培養(yǎng)方案。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Thermo Fisher公司，ALyS505NK-AC、ALyS505NK-EX培養(yǎng)基和CD16抗體購自日本株式會社細(xì)胞科學(xué)研究所，rhIL-2、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-18購自美國Pepro Tech公司，流式抗體CD3-FITC、CD25-PE、CD45-PerCP、CD56-PE購自美國BD Biosciences公司，CFSE購自日本同仁化學(xué)研究所，7-AAD購自美國Bio Legend公司，淋巴細(xì)胞分離液購自天津市瀚洋生物制品科技有限責(zé)任公司，腫瘤細(xì)胞株K562購自上海中科院細(xì)胞庫，ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

健康志愿者5例，年齡26～43歲?；羝娼鹆馨土龌颊?例，年齡分別為46歲和59歲。采集外周血50 ml，使用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMCs。使用NK細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞因子添加方式如下：A組（IL-2+IL-15聯(lián)合添加），第1天，用CD16抗體包被的T25培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，加入7 ml NK細(xì)胞初始培養(yǎng)基（含10%滅活人自體血清的ALyS505NK-AC培養(yǎng)基，并加入rhIL-21000 u/ml、rhIL-1520 ng/ml）；每3天補液，第14天，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)表型和功能實驗。B組（IL-2+IL-12+IL-15+IL-18聯(lián)合添加），其他操作過程與A組相同，rhIL-12添加濃度為10 ng/ml，rhIL-18添加濃度為50 ng/ml。C組（IL-12+IL-15+IL-18預(yù)處理/IL-2）：先使用細(xì)胞因子rhIL-12（10 ng/ml）+rhIL-18（50 ng/ml）+rhIL-15（1 ng/ml）預(yù)處理16 h，然后PBS洗滌2次，之后再按照與A組相同的方式進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，只添加rhIL-2（1000 u/ml）。

腫瘤細(xì)胞株K562用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，于37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 檢測細(xì)胞表型

收集培養(yǎng)7和14 d的各組NK細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)為1×107個/ml，標(biāo)志熒光抗體CD3-FITC、CD45-PerCP、CD56-PE，各組設(shè)同型IgG陰性對照，4℃避光孵育30 min后，PBS漂洗2次，然后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。對于CD25的檢測，細(xì)胞孵育CD25-PE熒光抗體，方法同上。

1.4 ELISA檢測IFN-γ的釋放

取培養(yǎng)14 d后的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，按照10∶1的比例在96孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)，每組NK細(xì)胞做3個復(fù)孔。共培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書操作方法進(jìn)行檢測。

1.5 NK體外殺傷K562腫瘤細(xì)胞實驗

NK細(xì)胞培養(yǎng)至第14天時，收集細(xì)胞進(jìn)行CFSE標(biāo)記。主要操作步驟如下：收集NK細(xì)胞并計數(shù)，使用CFSE標(biāo)記緩沖液（生理鹽水+1% FBS）洗滌1次，并重懸細(xì)胞（細(xì)胞密度為1×107個/ml）；加入CFSE（終濃度為200 nmol），置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育15min，生理鹽水洗滌2次，并用NK細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。在6孔板中加入0.5 ml K562細(xì)胞（1×105個/孔），然后按比例（5∶1、10∶1和20∶1）加入標(biāo)記好的NK細(xì)胞（總體積為1 ml），同時設(shè)置只有NK細(xì)胞或K562細(xì)胞的對照孔，置于培養(yǎng)箱共培養(yǎng)4 h。

收集共培養(yǎng)的細(xì)胞，使用7-AAD染色法檢測K562細(xì)胞的死亡率，主要操作如下：離心收集細(xì)胞，棄上清，加入100 μl染色緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl 7-AAD混勻，室溫避光放置15 min。同時設(shè)置不加7-AAD的陰性對照。然后加入400 μl染色緩沖液，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義后，再采用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子預(yù)處理對NK細(xì)胞擴增能力的影響

分別在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的第7天和第14天取樣，離心棄上清，加入適量PBS重懸后用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見圖1A所示，在第7天時，A、B、C組中細(xì)胞擴增倍數(shù)分別為（25.726±5.057）、（26.156±6.106）和（29.471±7.616），各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.313，P=0.743）。第14天時，3組細(xì)胞擴增倍數(shù)分別為（92.637±10.522）、（104.939±12.414）和（114.361±15.825），雖然C組的細(xì)胞擴增倍數(shù)略高于A和B組，但是組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.073，P=0.207）。由于現(xiàn)有的NK體外擴增方法得到的細(xì)胞除了NK以外，還有一定數(shù)量的T細(xì)胞和NKT細(xì)胞，因此使用流式細(xì)胞儀的方法檢測樣品中CD3和CD56的表達(dá)情況，并對其中NK細(xì)胞（CD3-CD56+）比例進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間的延長，各組培養(yǎng)方式下NK細(xì)胞比例也不斷增加，第7天時NK細(xì)胞比例分別為（31.048±4.428）%、（37.965±2.560）%和（40.277±5.229）%，第14天時NK細(xì)胞比例分別為（54.375±6.803）%、（57.033±6.773）%和（62.697+6.232）%（見圖1B），但是各組間NK細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.879和1.241，P=0.083和0.354）。以上結(jié)果表明，細(xì)胞因子預(yù)處理的培養(yǎng)方式（C組）能較好的擴增NK細(xì)胞，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方式（A和B組）的擴增能力相當(dāng)。

2.2 細(xì)胞因子預(yù)處理對NK細(xì)胞活性的影響

在第7天時取樣進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞因子預(yù)處理的方式C組可以提高CD25（IL-2Rα）的表達(dá)（陽性率為69.1%），而A和B組培養(yǎng)方式幾乎不能誘導(dǎo)CD25的表達(dá)（見圖2A）。ELISA檢測NK細(xì)胞與靶細(xì)胞（K562）共培養(yǎng)后上清中IFNγ的釋放情況，結(jié)果顯示各組細(xì)胞的IFNγ釋放量分別為（43.2±8.7）、（63.4±10.3）和（137.4±17.5）ng/ml，經(jīng)單因素方差分析各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.490，P=0.001）。進(jìn)一步兩兩比較表明，與A和B組比較，C組中細(xì)胞IFNγ釋放量較多（t=6.982和5.151，P=0.002和0.007），而A和B組細(xì)胞間IFNγ釋放量無明顯變化（t=2.609，P=0.060）（見圖2B）。

圖1 3種培養(yǎng)方式的擴增倍數(shù)和NK細(xì)胞比例

2.3 細(xì)胞因子預(yù)處理對NK細(xì)胞殺傷能力的影響

采用體外殺傷實驗進(jìn)一步證實NK細(xì)胞的活性。首先，使用CFSE標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞（Effector, E），結(jié)果顯示200 nmol的CFSE可以很好的標(biāo)記NK細(xì)胞（陽性率為＞99%），并且?guī)缀醪粫K細(xì)胞產(chǎn)生毒性（見圖3A）。然后，將標(biāo)記過的NK細(xì)胞與靶細(xì)胞K562（Target, T）按照5∶1、10∶1和20∶1的比例共培養(yǎng)，并通過7-AAD染色的方法統(tǒng)計K562細(xì)胞的死亡率，C組的NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖3B（E∶T=5∶1）。對各組細(xì)胞在不同比例下的殺傷結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，顯示預(yù)處理方式得到的NK細(xì)胞的殺傷能力最強，各比例下的殺傷率分別為（27.967±9.434）%、（65.233±9.069）% 和（82.967±6.804）%，并且在10∶1和20∶1的比例時，各組細(xì)胞殺傷率之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.416和9.191，P=0.018 和 0.015）（見圖 3C）。

2.4 腫瘤患者NK細(xì)胞擴增效果

從2例霍奇金淋巴瘤患者的外周血中分離PBMCs，然后使用細(xì)胞因子預(yù)處理的方法進(jìn)行NK細(xì)胞的擴增培養(yǎng)，14 d后取樣分析NK細(xì)胞的得率。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示（見圖4），2例腫瘤患者PBMCs均能成功擴增NK細(xì)胞（CD3-CD56+），其陽性率分別為62.63%和50.24%，而其他細(xì)胞（T細(xì)胞和NKT細(xì)胞）的比例較低。

圖2 3種培養(yǎng)方式下CD25的表達(dá)及NK細(xì)胞釋放IFNγ的比較

圖3 3種培養(yǎng)方式下NK細(xì)胞殺傷活性的比較

圖4 腫瘤患者NK細(xì)胞的擴增效果

3 討論

IL-12、IL-15、IL-18等細(xì)胞因子對NK細(xì)胞的功能具有重要的作用。在NK細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加不同種類的細(xì)胞因子，從而發(fā)展出多種培養(yǎng)方法[11]。不同的細(xì)胞因子組合和劑量等略有不同，而添加方式通常為持續(xù)添加。在體外擴增過程中持續(xù)添加細(xì)胞因子不但增加了培養(yǎng)成本，而且由于IL-12細(xì)胞因子會造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此要限制IL-12在NK細(xì)胞培養(yǎng)過程中的使用量以及殘余量。有研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，IL-12、IL-15和IL-18可能是通過促進(jìn)IFN-γ mRNA的合成以及蛋白質(zhì)的表達(dá)參與NK細(xì)胞早期的免疫應(yīng)答，并不涉及NK細(xì)胞的生長及活性維持。本研究探索了使用細(xì)胞因子預(yù)處理的培養(yǎng)方法，先使用IL-12、IL-15和IL-183種因子刺激16 h，然后使用只添加IL-2的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示IL-12、IL-15和IL-18預(yù)處理的培養(yǎng)方法能很好地擴增NK細(xì)胞，細(xì)胞擴增倍數(shù)和NK細(xì)胞比例與傳統(tǒng)的持續(xù)添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)方式相當(dāng)。NK細(xì)胞的生長依賴于IL-2信號通路，而IL-2的復(fù)合體形式?jīng)Q定了信號通路的敏感性，以及細(xì)胞因子刺激NK細(xì)胞活性的能力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-12、IL-15和IL-18預(yù)處理能上調(diào)細(xì)胞表面CD25（IL-2Rα）的表達(dá)，從而NK細(xì)胞表面可形成IL-2Rα/β/γ復(fù)合體，大大提高NK對于細(xì)胞因子刺激的敏感性，降低了細(xì)胞因子的使用量。值得注意的是，預(yù)處理的培養(yǎng)方式獲得的NK細(xì)胞的活性（IFNγ的釋放量和體外殺傷K562腫瘤細(xì)胞的能力）顯著提高。此外，IL-12+IL-15+IL-18預(yù)處理的培養(yǎng)方法還能夠有效擴增腫瘤患者自身的NK細(xì)胞。因此，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)方式下擴增的NK細(xì)胞，使用IL-12、IL-15和IL-18預(yù)處理的培養(yǎng)方式得到的NK細(xì)胞在臨床上具有更大的優(yōu)勢。