FSH處理對豬顆粒細胞中類固醇合成酶基因的表達及其調(diào)控區(qū)組蛋白H3修飾的影響

張金璧，姚望，潘增祥，劉紅林

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FSH處理對豬顆粒細胞中類固醇合成酶基因的表達及其調(diào)控區(qū)組蛋白H3修飾的影響

張金璧，姚望，潘增祥，劉紅林

（南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095）

【目的】研究FSH處理對豬卵巢顆粒細胞類固醇合成酶、垂體激素受體、凋亡相關等基因表達的影響及此過程中組蛋白H3修飾的變化情況?！痉椒ā渴紫?，采集豬卵巢組織并用注射器抽取方法收集卵泡顆粒細胞，用含血清體系體外培養(yǎng)顆粒細胞至貼壁，血清饑餓16h后用終濃度5IU?mL-1的FSH處理24h，并收集細胞。其次，提取細胞mRNA，采用qRT-PCR方法檢測類固醇合成酶（STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1）、垂體激素受體（FSHR和LHR）、凋亡相關基因（XIAP和FasL）mRNA的表達變化，最后，相同處理后固定細胞，采用染色質(zhì)免疫沉淀結合qPCR（ChIP-qPCR）方法檢測類固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)組蛋白H3修飾（H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac）狀況。【結果】5IU?mL-1的FSH處理引起類固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B分別為2倍（＜0.01）、2.8倍（＜0.01）和3.6倍（＜0.05）的顯著上調(diào)，而CYP11A1表達水平?jīng)]有顯著變化；FSH處理對垂體激素受體FSHR、LHR和凋亡相關基因XIAP、FasL影響不顯著。在上調(diào)的三個類固醇合成酶基因中，HSD3B調(diào)控區(qū)組蛋白H3修飾變化最為顯著，H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac結合分別有14.7倍（＜0.01）、 13.6倍（＜0.01）、19.7（＜0.01）倍和2.5倍（＜0.05）的顯著上調(diào)；STAR基因調(diào)控區(qū)的H3K9ac在處理后有11.1倍的顯著下降（＜0.05）；CYP19A基因調(diào)控區(qū)的H3K4me3和H3K9ac分別有0.5倍的上調(diào)（＜0.01）和10.4倍（＜0.01）的下降，其余組蛋白修飾在處理前后沒有顯著變化?！窘Y論】FSH處理24h對顆粒細胞類固醇合成酶基因轉(zhuǎn)錄有顯著上調(diào)作用，對其轉(zhuǎn)錄過程有H3組蛋白修飾參與，組蛋白修飾模式具有基因特異性。垂體激素受體和凋亡相關基因的應答可能需要FSH和其他因素的聯(lián)合作用。

豬；FSH；顆粒細胞；類固醇合成酶；組蛋白修飾

0 引言

【研究意義】組蛋白修飾調(diào)控是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制中的重要組成部分，其靈活快速的調(diào)控特點在細胞對微環(huán)境的應答過程中起到了重要作用。在哺乳動物基因組中，組蛋白具有多重修飾形式，包括組蛋白末端的乙?；痆1]、甲基化[2]、磷酸化[3]、泛素化[4]、ADP核糖基化[5]等。這些修飾模式多樣，在特定的細胞和狀態(tài)中對基因轉(zhuǎn)錄起到多樣化的調(diào)控作用。【前人研究進展】促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）是垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種糖蛋白激素，能與位于顆粒細胞膜上的特異性受體結合，激活細胞內(nèi)信號通道，對卵巢卵泡發(fā)育，激素分泌過程有重要的調(diào)節(jié)[6-7]外培養(yǎng)的顆粒細胞中，F(xiàn)SH能促進細胞生長，抑制細胞凋亡[8]，影響類固醇的生成，如促進孕酮的合成和分泌以及雌激素合成能力[9]。類固醇合成酶是一類催化性腺中類固醇激素合成的酶類，其催化合成的激素包括睪酮、孕酮和雌二醇等[10]。其中類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR，由STAR基因編碼）負責將膽固醇由線粒體外膜或細胞質(zhì)向線粒體內(nèi)膜運送[11]；P450膽固醇側鏈裂解酶（P450scc，由CYP11A1基因編碼）催化膽固醇形成孕烯醇酮[12-13]；隨后在3b-羥甾脫氫酶（3b-HSD，由HSD3B基因編碼）的作用下生成孕酮。孕酮是類固醇合成過程中的基礎甾體，在卵泡膜細胞中，由C17-20裂解酶（P450c17，由CYP17C編碼）催化生成睪酮[14]。最后在顆粒細胞中由芳香化酶（P450arom，由CYP19編碼）氧化脫去19-甲基，芳香構化轉(zhuǎn)變成C18雌激素（雌酮和雌二醇）[15]。FSH對垂體激素受體和凋亡相關基因的誘導具有時間上和物種間的差異，也與體外培養(yǎng)的條件有關?！颈狙芯壳腥朦c】一般認為H3K4的2, 3甲基化可能與轉(zhuǎn)錄抑制相關，而聯(lián)合參入的H3K9與 H3K14的乙?；赡芘c轉(zhuǎn)錄激活相關，單獨的H3K14的乙?；瘎t與轉(zhuǎn)錄抑制相關[16-17]。體外培養(yǎng)的顆粒細胞是卵巢研究中常用的實驗對象，研究者們對FSH處理引起的基因應答已有一定認識，但組蛋白修飾在這些應答中是否參與，如何參與，是否具有特異性等問題尚不明確。【擬解決的關鍵問題】本文旨在明確體外培養(yǎng)的豬顆粒細胞中類固醇合成酶基因在FSH處理下的轉(zhuǎn)錄變化情況，并探索這些基因轉(zhuǎn)錄水平變化與其調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的關系。對各組蛋白修飾對FSH的精確應答時間及其在基因調(diào)控區(qū)的詳細分布狀況進行深入研究，繪制組蛋白應答的時空圖譜，將進一步完善FSH對顆粒細胞生理的調(diào)控原理。

1 材料與方法

本研究于2016年9月至2017年2月在南京農(nóng)業(yè)大學動物科學類實驗教學中心（國家實驗教學示范中心）完成。

1.1 樣品采集

豬卵巢選自淮安蘇食肉品屠宰點，屠宰后10min內(nèi)采集雙側卵巢，置于37℃含雙抗（青霉素、鏈霉素各100U?mL-1）的生理鹽水中，3h內(nèi)帶回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.2 顆粒細胞培養(yǎng)

清洗卵巢，用注射器抽取直徑為3—6mm卵泡的卵泡液及顆粒細胞，800×g離心5min去除卵泡液；PBS清洗顆粒細胞兩次，800×g離心5min去除PBS后，用完全培養(yǎng)基（含體積分數(shù)15%胎牛血清和100 U?mL-1雙抗DMEM/F12培養(yǎng)基）重懸細胞，充分吹打至散開并接種于T25培養(yǎng)瓶中；放置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)。24h后觀察顆粒細胞貼壁情況，棄去培養(yǎng)基及未貼壁的顆粒細胞、卵母細胞，清洗貼壁的顆粒細胞，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；待細胞長至90%匯合度時傳代；傳代時用PBS清洗細胞兩次，加入1mL胰酶消化細胞，觀察到大部分細胞漂起時即加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，吹打分散細胞；800×g離心5min，棄去上清，并用完全培養(yǎng)基重懸細胞后接種于6孔板中（約105個/孔）繼續(xù)后續(xù)試驗。

1.3 FSH激素處理

正常培養(yǎng)顆粒細胞48h后，換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)16h，試驗組加入5IU/mL的FSH（寧波第二激素廠），對照組加入同等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用PBS沖洗細胞兩次，按照Trizol試劑（Invitrogen公司）說明書提取顆粒細胞RNA（每個孔用量1mL），紫外比色法測定總RNA的濃度和純度，用1.4%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。取1μg質(zhì)量合格的總RNA用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）和oligo(dT)18進行cDNA第一鏈合成，具體步驟按說明書操作。cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）

PBS清洗顆粒細胞2次，用終濃度1%的甲醛體外交聯(lián)顆粒細胞，從培養(yǎng)瓶中收集細胞后，1%SDS裂解液裂解細胞，超聲波斷裂染色質(zhì)，加特異性抗體（H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac，CST公司）進行免疫共沉淀，洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)后，用DNA純化試劑盒（Qiagen公司）進行DNA純化，最后以沉淀所得的DNA為模板，進行qPCR。

1.6 引物設計與qPCR反應

定量引物設計：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的基因mRNA序列和qPCR反應要求，用Primer Premier5.0軟件設計引物；ChIP引物設計：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的相應基因序列，選取轉(zhuǎn)錄起始位點到上游1 000bp以內(nèi)位置，用Primer Premier5.0軟件設計引物。全部引物由上海英駿生物技術有限公司合成，使用時用ddH2O稀釋至工作濃度。實時熒光定量PCR反應依試劑盒（Takara公司）說明操作。根據(jù)文獻[18]的方法進行數(shù)據(jù)分析，即ΔCT= CT目標基因-CT內(nèi)參基因，目標基因的CT 相對于內(nèi)參基因的CT 為2-ΔCT，轉(zhuǎn)基因植株基因表達的變化表示為對照的2-ΔCT記為1時目標基因2-ΔCT的相對值（即2-ΔΔCT），各基因表達量用均值表示。引物序列信息和擴增條件見表1。

2 結果

2.1 FSH處理對顆粒細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.1.1 類固醇合成酶基因 本試驗共檢測了4個類固醇合成酶基因的表達水平，分別為STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1。在FSH處理24h后的顆粒細胞中，STAR、HSD3B和CYP19A1的表達水平有顯著上升，相比對照組而言，處理組的表達水平分別達到了2倍（＜0.01）、2.8倍（＜0.01）和3.6倍（＜0.05）。而CYP11A1表達水平?jīng)]有顯著變化（圖1）。

*. P＜0.05，**. P＜0.01 下同 The same as below

2.1.2 垂體激素受體基因 顆粒細胞中垂體激素FSH和LH的受體FSHR和LHR的mRNA表達水平在FSH處理24h后相比對照組沒有顯著差異（圖2）。

2.1.3 凋亡相關基因 對抗凋亡基因XIAP和凋亡標志基因FasL-2表達水平進行檢測，結果證明FSH處理并沒有顯著改變顆粒細胞中這兩個凋亡相關基因的表達水平（圖3）。

2.2 FSH處理對顆粒細胞類固醇合成酶基因調(diào)控區(qū)組蛋白修飾的影響

2.2.1 HSD3B基因的組蛋白修飾變化 在FSH處理24 h后，HSD3B基因上游調(diào)控區(qū)的組蛋白H3修飾發(fā)生了顯著變化（圖4）。其中H3K4me2、H3K4me3、H3K4ac和H3K14ac的結合水平分別上升了14.7倍（＜0.01）、13.6倍（＜0.01）、19.7（＜0.01）倍和2.5倍（＜0.05），差異均達到了顯著水平。結果說明HSD3B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與所檢測的組蛋白修飾關聯(lián)最為緊密。

表1 PCR引物及反應條件

圖2 FSH處理對顆粒細胞垂體激素受體基因的表達水平的影響

圖3 FSH處理對顆粒細胞凋亡相關基因的表達水平的影響

圖4 FSH處理對顆粒細胞HSD3B基因上游調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的影響

2.2.2 STAR、CYP19A基因的組蛋白修飾變化 在FSH處理24h后，STAR基因調(diào)控區(qū)的H3K9ac在處理后有11.1倍的顯著下降（＜0.05, 圖5）；CYP19A基因調(diào)控區(qū)的H3K4me3和H3K9ac分別有0.5倍（＜0.01）的上調(diào)和10.4倍（＜0.01）的下降，其余組蛋白修飾在處理前后沒有顯著變化（圖6）。結果說明組蛋白修飾具有基因特異性，在不同類固醇合成酶基因中的參與有所不同。

圖5 FSH處理對顆粒細胞STAR基因上游調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的影響

3 討論

3.1 FSH提升類固醇合成酶基因表達水平

FSH在雌性動物中能抑制卵泡凋亡、促進卵泡的生長、顆粒細胞增殖以及類固醇激素的合成和分泌[19]。筆者的試驗證實，24h的FSH處理讓卵泡類固醇合成3個主要合成酶基因STAR、HSD3B和CYP19A1的表達量有了顯著上升。在卵巢類固醇激素合成過程中（圖7），STAR編碼的類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白負責類固醇“原料”膽固醇的轉(zhuǎn)運，而HSD3B編碼的3b-羥甾脫氫酶是孕酮的主要合成酶，這兩種酶表達量的升高理論上為進一步合成雌激素提供了反應底物。而CYP19編碼的芳香化酶是雌激素合成的關鍵酶，其表達水平上升與FSH對顆粒細胞雌激素合成的影響和對卵泡健康發(fā)育的維持功能相吻合。同時，另一個合成酶基因CYP11A1的表達量卻沒有顯著變化，一方面可能由于其編碼的膽固醇側鏈裂解酶及其催化產(chǎn)物孕烯醇酮可能在短期內(nèi)較為充足，不會限制后續(xù)類固醇的合成，另一方面可能由于24h的處理時間不足讓此基因在表達水平上產(chǎn)生回應。在小鼠和大鼠體外培養(yǎng)的顆粒細胞模型中有研究報道STAR對FSH的應答極快，3h后既能檢測到mRNA的上調(diào)，而CYP11A1應答較為緩慢，在24h才檢測到mRNA的表達變化[20]，這一結果支持了后一種可能。

3.2 FSH處理對垂體激素受體的影響

除了類固醇合成酶，本研究對垂體激素受體基因FSHR和LHR的表達水平進行了檢測。在雌性動物卵泡中，F(xiàn)SH和雌激素的協(xié)同作用會促進顆粒細胞表達更多FSH及LH受體，增加卵泡對促性腺激素的敏感性，較高的LH受體水平是大卵泡走向成熟和排卵的關鍵因素之一。但在體外培養(yǎng)的豬顆粒細胞中，24h的FSH處理并沒有導致顯著的FSHR和LHR水平變化。在其他物種的類似研究中發(fā)現(xiàn)，48h的FSH處理能誘導體外培養(yǎng)的小鼠顆粒細胞FSHR水平升高[21]， 24h的FSH處理在大鼠顆粒細胞中引起FSHR顯著升高[22]，在體外培養(yǎng)的羊卵丘卵母細胞復合體（COC）中，10IU?mL-1濃度的FSH能顯著上調(diào)FSHR和LHR的mRNA水平[23]。然而，在牛顆粒細胞中，單獨的FSH處理對FSHR的mRNA水平?jīng)]有顯著影響，僅有在與5-α-二氫睪丸酮(DHT)聯(lián)合處理細胞時才能引起FSHR水平的升高[24]。在LHR對FSH的應答方面，早年有報道證實LHR對FSH的應答需要顆粒細胞和其他類型細胞的協(xié)同配合，因此只有在體內(nèi)、卵泡培養(yǎng)中才能觀測到LHR上調(diào)。培養(yǎng)體系中的血清對LHR的應答有較大影響，大鼠無血清培養(yǎng)的顆粒細胞中也有LHR上調(diào)的報道[25]。結合的試驗結果和他人的研究結論可見，F(xiàn)SH在豬、牛等動物中的作用與在小鼠、大鼠等物種中有所差別，F(xiàn)SH對垂體激素受體的誘導具有時間上和物種間的差異，另外也與體外培養(yǎng)的條件有關。

圖6 FSH處理對顆粒細胞CYP19A基因上游調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的影響

類固醇用加粗表示，相應合成酶用橢圓表示 Steroid hormones are in bold, steroidogenic enzymes are encircled

3.3 FSH處理對凋亡相關基因沒有顯著影響

對抗凋亡基因X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）和凋亡標志基因FasL-2的表達水平的檢測證明FSH處理對這2個基因表達沒有顯著影響。在體內(nèi)試驗和體外培養(yǎng)的卵泡中均有研究證實FSH處理能上調(diào)XIAP表達水平[26-27]，而下調(diào)FasL的表達水平[28]。但由于體外培養(yǎng)的顆粒細胞模型與完整卵泡相比，在FSH應答方面有一定差異，單獨的FSH處理不足以引起XIAP和FasL-2的轉(zhuǎn)錄變化，但與其他激素，如甲狀腺激素三碘甲狀腺氨酸（T3）的聯(lián)合處理則能誘導這兩個基因的顯著變化[29]。

3.4 FSH處理對調(diào)控區(qū)組蛋白修飾的影響具有基因特異性

目前，對FSH處理的顆粒細胞模型中組蛋白修飾變化的研究鮮有報道，卵泡中的組蛋白修飾研究較多集中在黃體化過程中，在黃體化的大鼠體內(nèi)試驗中，卵巢顆粒細胞對LH的應答使STAR和CYP19A1轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，而這些變化與H4ac和H3K4me3修飾顯著相關[30]。DEBORAH等證實了全染色質(zhì)水平的H3S10磷酸化在FSH處理24h后有顯著上升[31]。本研究首次在基因水平上對體外培養(yǎng)的豬顆粒細胞組蛋白修飾對FSH處理的反應進行了檢測，結果證明組蛋白修飾具有基因特異性。在3個受FSH調(diào)控上調(diào)的類固醇合成酶基因中，HSD3B的調(diào)控區(qū)組蛋白H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac修飾顯著提升，CYP19A1基因調(diào)控區(qū)的H3K4me3修飾也有顯著上升，這些修飾在多數(shù)情況下均與轉(zhuǎn)錄活化相關[32]；相反，STAR和CYP19A1基因調(diào)控區(qū)的H3K9ac在處理后有所下降，可見FSH處理對調(diào)控區(qū)組蛋白修飾的影響具有基因特異性。

4 結論

FSH處理讓卵泡類固醇合成3個主要合成酶基因STAR、HSD3B和CYP19A1的表達量有了顯著上升，CYP11A1應答較為緩慢。FSH對垂體激素受體和凋亡相關基因的誘導具有時間上和物種間的差異，也與體外培養(yǎng)的條件有關。對上游調(diào)控區(qū)組蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)這些基因的表達變化與組蛋白修飾有關，其中HSD3B的表達增高伴隨著組蛋白H3K4me2、 H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac修飾的顯著提升。本研究為進一步完善FSH對卵巢顆粒細胞的影響及調(diào)控機理提供了參考。

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（責任編輯 林鑒非）

Effects of FSH Treatment on Steroidogenic Enzymes Expression and Histone H3 Modification in Pig Granulosa Cells

ZHANG JinBi, YAO Wang, PAN ZengXiang, LIU HongLin

(College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

【Objective】The objective of this study was to explore whether FSH treatment affect expressions of genes including steroidogenic enzymes, pituitary hormone receptors and apoptosis related genes in porcine granulosa cells, and to detect the histone H3 modification on specific gene regulation regions involved in this process. 【Method】 Firstly, ovary granulosa cells were collected using syringe extraction method from porcine ovaries and cultured in media with serum until the cells attached. After 16 h of non-serum culture, granulosa cells were treated by 5 IU?mL-1FSH for another 24 h culture and harvested for following experiment. Secondly, transcriptional expression changes of steroidogenic enzymes (STAR, CYP11A1, HSD3B and CYP19A1), pituitary hormone receptors (FSHR and LHR) and apoptosis related genes (XIAP and FasL) were detected using qRT-PCR method. Finally, histone H3 modification (H3K4me2, H3K4me3, H3K9ac and H3K14ac) status on regulatory regions of STAR, CYP19A1 and HSD3B genes were detected by ChIP-qPCR.【Result】 Treatment of 5 IU?mL-1FSH induced a significant upregulation of STAR, CYP19A1 and HSD3B genes with fold changes of 2 (＜0.01), 2.8 (＜0.0), and 3.6 (＜0.05), respectively, but had no significant effect on CYP11A1, pituitary hormone receptors FSHR, LHR and apoptosis related genes XIAP, FasL. Among the three steroidogenic genes, the histone modifications of HSD3B regulatory region were the most significant. The fold change of H3K4me2, H3K4me3, H3K9ac and H3K14ac was 14.7 (＜0.01), 13.6 (＜0.01), 19.7 (＜0.01) and 2.5 (＜0.05), respectively. H3K9ac on STAR gene regulation region decreased 11.1 (＜0.01) times. H3K4me3 on CYP19A regulation region increased 0.5 (＜0.01) times while H3K9ac decreased 10.4 (＜0.01) times. Other histone modification changes were not significant. 【Conclusion】24 h of FSH treatment enhanced the transcription levels of steroidogenic enzymes in pig granulosa cells. The up-regulation process involved H3 histone modifications in a gene-specific manner. Independent FSH treatment was not capable to induce significant effect on candidate pituitary hormone receptor and apoptosis related genes.

pig; FSH; granulosa cells; steroidogenic enzymes; histone modification

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.014

2017-04-25；

2018-07-06

國家自然科學基金重點項目（31630072）、江蘇省自然基金（No. BK20160721 & BK20161453）

張金璧，E-mail：zhangjinbi@njau.edu.cn。通信作者劉紅林，E-mail：liuhonglin@njau.edu.cn