淺析數(shù)碼顯微鏡分辨率的影響因素

陳木旺

摘要：從奈奎斯特采樣定理、光源兩方面分析對(duì)數(shù)碼顯微圖像分辨率的影響，表明在物鏡確定的情況下，需要選擇合適的攝像頭、攝像接頭、光源、濾色片等，以滿足采樣定理，有效發(fā)揮物鏡的分辨率，準(zhǔn)確重建出數(shù)字圖像。

關(guān)鍵詞：數(shù)碼顯微圖像； 奈奎斯特定理； 光譜

中圖分類號(hào)： TH 742 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A doi： 10.3969/j.issn.1005 5630.2018.03.006

Abstract： In this paper，the influence factors of the digital microscope image resolution are analyzed from Nyquist sampling theorem and light source spectrum.It indicates that in the case of a certain objective，the appropriate camera，camera adaptor，light source，filters，etc should be selected to meet Nyquist sampling theorem.And then it can effectively achieve the high resolution of the objective and accurately reconstruct the digital image.

Keywords：digital microscopy image； Nyquist theorem； spectrum

引 言

數(shù)碼顯微鏡是在傳統(tǒng)顯微鏡上增加了數(shù)字圖像傳感器CCD或CMOS的顯微鏡，與計(jì)算機(jī)、圖像處理、自動(dòng)化、互聯(lián)網(wǎng)等技術(shù)相結(jié)合，可衍生出多種產(chǎn)品和應(yīng)用，如自動(dòng)顯微鏡、數(shù)碼互動(dòng)顯微鏡、數(shù)字切片掃描儀等，能給用戶帶來(lái)極大的便利，在教學(xué)、醫(yī)療、科研等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1 4]，可以說(shuō)數(shù)碼顯微鏡是傳統(tǒng)顯微鏡的一次重大變革。

將傳統(tǒng)的顯微圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)碼顯微圖像，實(shí)際上是一個(gè)圖像數(shù)字化和重建的過(guò)程。為了使顯微圖像準(zhǔn)確重建，達(dá)到人眼的觀察效果，需要兩者的分辨率一致。

作為傳感器，人眼和數(shù)字圖像傳感器CCD/CMOS主要有兩方面的不同：一是數(shù)字圖像傳感器是由很多離散的感光器件組成，用其作為傳感器接收顯微圖像，實(shí)際上是一個(gè)數(shù)字化過(guò)程（也稱為空間采樣），需要滿足采樣定理即奈奎斯特定理，這樣圖像才能準(zhǔn)確重建；二是數(shù)字圖像傳感器的響應(yīng)波長(zhǎng)與人眼不一樣，所以會(huì)受光源光譜特性的影響。本文從空間采樣率和光源這兩方面來(lái)分析對(duì)數(shù)碼顯微圖像分辨率的影響。

1 空間采樣率對(duì)數(shù)碼顯微圖像分辨率的影響

奈奎斯特采樣定理是指將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)時(shí)，要求采樣頻率fs要大于模擬信號(hào)中最高頻率fmax的2倍，即fs>2fmax，才可以通過(guò)采樣之后的數(shù)字信號(hào)準(zhǔn)確地重建出模擬信號(hào)。對(duì)于顯微圖像的數(shù)字化，其最高頻率就是由物鏡的極限分辨率決定的，采樣頻率也稱為空間采樣率，一般實(shí)際應(yīng)用時(shí)要求空間采樣率為物鏡的極限分辨率的2.8倍左右[5]。

式中：p為數(shù)字圖像傳感器像素的邊長(zhǎng)；β1為顯微物鏡的放大倍率；β2為攝像鏡頭的放大倍率。

因此改變攝像鏡頭的放大倍率，可以改變空間采樣率。我們可以選用一組不同放大倍率的攝像鏡頭實(shí)現(xiàn)不同的空間采樣率，以研究空間采樣率對(duì)數(shù)碼圖像分辨率的影響。具體實(shí)驗(yàn)條件如下：

顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司的BA310顯微鏡。

光源：白光LED和鹵素?zé)簦苫Q），帶有550/20 nm的干涉濾色片。

顯微物鏡：40×/0.75，根據(jù)式（1），其極限分辨率為0.45 μm。

攝像頭：黑白攝像頭，型號(hào)為CM3 U3 50S5M，像素邊長(zhǎng)為3.45 μm。

觀察標(biāo)本：采用USAF1951鑒別率板（如圖1所示）[7]，40×/0.75顯微物鏡可觀察的極限線對(duì)數(shù)為2 048（11 1組）。

攝像鏡頭倍率：0.35×、0.5×、1×分別對(duì)應(yīng)三種不同的采樣率，采集的圖像如圖2所示，結(jié)果如表1所示。

由此可見：在沒有滿足采樣定理的情況下即欠采樣，數(shù)碼顯微圖像分辨率會(huì)降低；在過(guò)采樣的情況下，并不會(huì)帶來(lái)數(shù)碼顯微圖像分辨率的提升。

2 光源對(duì)數(shù)碼顯微圖像分辨率的影響

式（1）提及的波長(zhǎng)λ是最終被傳感器接收的波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)與傳感器響應(yīng)曲線和光源光譜特性有關(guān)。

作為傳感器，人眼的響應(yīng)波長(zhǎng)為400～700 nm，即通常說(shuō)的可見光，如圖3所示。而對(duì)于數(shù)字圖像傳感器CCD/CMOS，其響應(yīng)波長(zhǎng)更寬，包括人眼不敏感的紫外和近紅外部分，其中近紅外的波長(zhǎng)更長(zhǎng)，如圖4所示，這會(huì)導(dǎo)致顯微鏡分辨率的下降。因此當(dāng)光源的光譜包含有人眼不敏感的近紅外光 譜或者紫外光譜時(shí)，在使用數(shù)字圖像傳感器時(shí)就會(huì)有影響。顯微鏡中常用的光源有白光LED和鹵素?zé)?，其中白光LED的光譜是450～700 nm，如圖5所示，與人眼的響應(yīng)曲線比較接近，而鹵素?zé)舻墓庾V為400～2 500 nm[8]， 如圖6所示，包括了更長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外部分。在分別使用鹵素?zé)艉桶坠釲ED時(shí)，由圖像傳感器得到的結(jié)果是有區(qū)別的，如圖7（a）和（b）所示。

表2為不同光源下的數(shù)碼顯微圖像分辨率，可以發(fā)現(xiàn)，人眼在不同光源下觀察到的極限線對(duì)是一樣的，都是2048線對(duì)，而對(duì)于數(shù)碼顯微圖像，采用鹵素?zé)魰r(shí)，觀察到的分辨率會(huì)有所下降。主要原因在于鹵素?zé)粲屑t外光譜，人眼直接觀察時(shí)會(huì)將紅外部分濾掉，所以效果與LED相當(dāng)，而數(shù)字圖像傳感器可以響應(yīng)鹵素?zé)舻募t外波長(zhǎng)，所以分辨率會(huì)下降。解決辦法就是數(shù)字傳感器前放置一個(gè)紅外濾色片（俗稱IR cut），將鹵素?zé)舻募t外部分濾除，得到接近于人眼的響應(yīng)曲線，這樣就與目視觀察結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

在使用數(shù)碼顯微鏡時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵從采樣定理，并深入研究數(shù)碼顯微鏡各個(gè)關(guān)鍵部件，這樣才能選擇合適的攝像鏡頭、光源、濾色片等，才能滿足采樣定理，準(zhǔn)確重建出數(shù)字圖像，達(dá)到最佳的觀察效果。

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[8] Education in Microscopy and Digital Imaging[EB/OL].[2017 11 24].http：∥zeiss ampus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/leds.html.

（編輯：劉鐵英）