食品抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚與溶菌酶結(jié)合特性的熒光光譜學(xué)研究

吳 笛， 梅 森， 胡 霞， 包苗苗， 康馨樾， 王 衛(wèi)

(1.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610106； 2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

0 引 言

目前，酚類抗氧化劑作為食品添加劑被廣泛用于食品的生產(chǎn)加工過(guò)程中，以抵抗因氧化引起的脂肪酸敗、顏色改變等食品腐壞[1].叔丁基對(duì)苯二酚(Tert-butylhydroquinone，TBHQ)是一種脂溶性酚類食品抗氧化劑，常被用來(lái)保護(hù)食品的油脂和脂肪，其能有效地抑制豬油、家禽脂肪的氧化變質(zhì)[2].但現(xiàn)有的TBHQ作為食品防腐用化學(xué)制品的應(yīng)用條例的相關(guān)規(guī)定并不嚴(yán)格.有研究表明，TBHQ會(huì)傷害生物體自身的防御機(jī)制，且該酚類食品抗氧化劑在其代謝途徑中還可能存在潛在的致突變、致癌性等情況[3-5].溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一類具有抗菌作用的蛋白酶，它是一個(gè)單一的、由129個(gè)氨基酸殘基折疊并帶有2個(gè)域的非糖基化多肽鏈，且其中含6個(gè)色氨酸和3個(gè)酪氨酸[6-7].這種蛋白質(zhì)天然豐度高，作為生物體內(nèi)的酶具有獨(dú)特的可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的能力，從而防止細(xì)菌感染[8].當(dāng)多樣的內(nèi)生和外生有機(jī)小分子進(jìn)入人體，配體與LYZ的結(jié)合容易被觀察到[9].因此，本研究將LYZ選作與TBHQ在人體內(nèi)相互作用的研究對(duì)象，在分子水平上探究苯酚類抗氧化劑與抗菌功能性蛋白質(zhì)間的相互作用機(jī)理，以探討有潛在毒性的食品添加劑在人體內(nèi)可能的傳遞途徑.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：TBHQ(批號(hào)，209429，純度>99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LYZ(批號(hào)，A610308，純度>98%)，上海生工生物工程股份有限公司；無(wú)水乙醇(批號(hào)，2017092102)，成都市科龍化工試劑廠；磷酸鹽(PBS)緩沖液干粉(批號(hào)，P1022)，北京索萊寶科技有限公司；華法林(批號(hào)，419960，純度≥98%)、布洛芬(批號(hào)，408218，純度≥98%)，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；三蒸水，實(shí)驗(yàn)室自制.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：CARY Eclipse型熒光光譜儀(美國(guó)VARIAN公司)；Horiba Jobin Yvon FluoroLog-TCSPC型熒光光度計(jì)(法國(guó)HORIBA科學(xué)儀器公司)；pHS-3C型精密pH計(jì)(雷磁—上海精科有限公司)；BS-224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；HH-S6型恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 樣品制備.

TBHQ溶解在無(wú)水乙醇中，儲(chǔ)備液濃度為2.0×10-3mol/L；LYZ儲(chǔ)備液(1.0×10-4mol/L)由0.05 mol/LPBS緩沖溶液配制(含0.1 mol/L氯化鈉調(diào)節(jié)樣品溶液離子強(qiáng)度).

在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，首先對(duì)PBS緩沖溶液的pH值的選擇進(jìn)行了測(cè)試，即向處于生理酸堿性條件(pH 7.4)和處于LYZ最適pH條件(pH 6.5)的LYZ溶液中分別加入0×10-6、1.0×10-6、1.5×10-6、2.0×10-6、3.0×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5mol/L的TBHQ溶液，發(fā)現(xiàn)pH值為6.5時(shí)，該狀態(tài)更適合LYZ穩(wěn)定地與有機(jī)小分子反應(yīng)，故本實(shí)驗(yàn)中PBS緩沖液的pH值均為6.5.在實(shí)驗(yàn)中，LYZ的濃度由其溶液在波長(zhǎng)280 nm處的摩爾消光系數(shù)值37 750 mol-1·cm-1校正確定[10].同時(shí)，所有溶液均在使用時(shí)稀釋至所需濃度，并在4 ℃條件下避光保存.

1.3.2 熒光滴定.

熒光強(qiáng)度測(cè)定時(shí)，在2.0×10-6mol/L的LYZ溶液中分別滴加0×10-6、1.0×10-6、2×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5、1.2×10-5mol/L的TBHQ溶液.用PBS緩沖溶液定容，渦旋混勻，分別在25 ℃、31 ℃及37 ℃條件下反應(yīng)1 h.測(cè)定所用石英比色池光程為1.0 cm，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫為10 nm，測(cè)量范圍為300～500 nm.

同時(shí)，所有熒光強(qiáng)度的測(cè)量都按照文獻(xiàn)[11]中的相關(guān)方法進(jìn)行內(nèi)濾效應(yīng)的校正.

1.3.3 同步熒光.

在與熒光滴定實(shí)驗(yàn)相同條件下，激發(fā)波長(zhǎng)范圍設(shè)置為200～400 nm，激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的差值(Δλ)分別為15 nm和60 nm，分別對(duì)應(yīng)酪氨酸和色氨酸微環(huán)境特征，狹縫寬度設(shè)置與熒光強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)相同.

1.3.4 三維熒光.

室溫下，掃描TBHQ存在與否時(shí)的LYZ的三維熒光譜圖，LYZ的濃度為2.0×10-6mol/L，混合體系樣品由LYZ和TBHQ以摩爾比1∶10組成.測(cè)定時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)的變化范圍為200～400 nm，變化間隔為5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)收集范圍為200～500 nm.

影響家庭教育的因素，其影響面常常不是單線的，而是會(huì)有多方面的綜合影響。年輕父母要綜合檢視對(duì)兒童發(fā)展有重要影響的各類因素，如父母影響力、媒體、同伴、周圍環(huán)境影響因素等，并對(duì)這些影響因素可能產(chǎn)生的多方面影響都加以監(jiān)控。比如，電子產(chǎn)品對(duì)孩子的影響，不僅在于孩子長(zhǎng)時(shí)間看手機(jī)電視，增加眼睛負(fù)擔(dān)影響視力，減少學(xué)習(xí)時(shí)間影響學(xué)習(xí)，還要關(guān)注到孩子過(guò)度使用電子產(chǎn)品對(duì)其社會(huì)性發(fā)展的深層次影響，如對(duì)孩子人際交往能力和性格形成的影響，對(duì)親子關(guān)系的影響等。

1.3.5 熒光壽命.

熒光壽命的測(cè)試在FluoroMax-4模塊式熒光光譜儀完成.室溫下設(shè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為345 nm.測(cè)試樣品共計(jì)3個(gè)樣：在2.0×10-6mol/L的LYZ溶液中分別滴加0×10-6、4.0×10-6、1.2×10-5mol/L的TBHQ溶液.

1.3.6 數(shù)據(jù)分析.

在熒光滴定實(shí)驗(yàn)中，所有的結(jié)果均為3次獨(dú)立重復(fù)性實(shí)驗(yàn)得到.最大的實(shí)驗(yàn)測(cè)量誤差保持在5%以內(nèi).數(shù)據(jù)在經(jīng)過(guò)方差分析后由OriginPro軟件處理，其中，熒光壽命的數(shù)據(jù)處理采用迭代擬合方法，并以χ2值及殘差值進(jìn)行評(píng)估.

2 結(jié)果與分析

2.1 TBHQ和LYZ相互作用機(jī)理分析

2.1.1 熒光猝滅分析.

熒光測(cè)量能夠提供小分子物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合信息[12].LYZ是一個(gè)具有多色氨酸(Tryptophan，Trp)殘基的蛋白質(zhì)，其單晶結(jié)構(gòu)顯示，每一個(gè)LYZ分子有6個(gè)色氨酸.色氨酸具有顯著的熒光強(qiáng)度和對(duì)周圍微環(huán)境敏感的特性，可作為L(zhǎng)YZ內(nèi)源性熒光探針.當(dāng)LYZ和其他化合物作用時(shí)，它的內(nèi)源性熒光(主要由編號(hào)為Trp62，Trp63和Trp108的氨基酸貢獻(xiàn))會(huì)隨配體的濃度改變而變化，從而提供配體導(dǎo)致LYZ熒光現(xiàn)象變化的信息[13].在配體小分子和LYZ發(fā)生作用時(shí)，LYZ分子可能發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，與基質(zhì)相結(jié)合、離解或變性等情況，這將導(dǎo)致其本身的熒光強(qiáng)度降低而發(fā)生熒光猝滅.測(cè)試溫度為25 ℃時(shí)，1～7號(hào)樣品中，LYZ濃度保持恒定，TBHQ濃度等梯度增加，TBHQ對(duì)LYZ的熒光猝滅圖譜如圖1所示.

圖1 TBHQ對(duì)LYZ的熒光猝滅圖譜(25 ℃)

由圖1可見，體系中加入TBHQ后，LYZ內(nèi)源熒光強(qiáng)度明顯降低，且隨著TBHQ濃度增加，猝滅效果增強(qiáng).結(jié)果表明，當(dāng)LYZ與TBHQ共存于一個(gè)體系中時(shí)，兩者之間會(huì)發(fā)生某種作用，從而導(dǎo)致LYZ內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低，而該熒光猝滅機(jī)制與溫度密切相關(guān).對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)采用Stern-Volmer方程[14]來(lái)分析不同溫度下(25 ℃、31 ℃及37 ℃)的熒光猝滅類型.

(1)

式中F0和F分別為加入TBHQ前后LYZ的熒光強(qiáng)度；[Q]為TBHQ濃度；KSV由F0/F對(duì)[Q]線性回歸作圖得到，為Stern-Volmer方程的猝滅常數(shù).

由恒溫梯度所得數(shù)據(jù)，經(jīng)Stern-Volmer方程擬合，得到3個(gè)溫度下猝滅常數(shù)KSV分別為，1.982×104L/mol(25 ℃，R2=0.9877)、1.925×104L/mol(31 ℃，R2=0.9900)和1.894×104L/mol(37 ℃，R2=0.9880).擬合數(shù)據(jù)顯示，猝滅常數(shù)隨溫度升高而略減小，根據(jù)熒光猝滅理論[12]，TBHQ可能與LYZ結(jié)合形成了體系復(fù)合物，發(fā)生了靜態(tài)猝滅.

2.1.2 熒光壽命分析.

由“2.1.1”項(xiàng)中Stern-Volmer方程擬合結(jié)果可知，隨著溫度的增加，猝滅常數(shù)KSV逐漸減小，但這種趨勢(shì)并不太明顯.為進(jìn)一步闡明該體系的熒光猝滅機(jī)理，本研究檢測(cè)得到了熒光體的熒光壽命τ值的變化，結(jié)果如圖2所示.

圖2不同濃度TBHQ對(duì)應(yīng)的LYZ的熒光衰減曲線

由于基態(tài)復(fù)合物的形成不會(huì)改變未結(jié)合熒光體的熒光衰減時(shí)間，因此，熒光體的熒光壽命會(huì)保持不變.猝滅劑與熒光體在飽和情況下，檢測(cè)的是復(fù)合體的熒光壽命，此時(shí)相對(duì)于空白熒光體的熒光壽命，復(fù)合體可能出現(xiàn)輕微壽命減弱的情況.動(dòng)態(tài)猝滅是作用在整個(gè)激發(fā)態(tài)的過(guò)程，這會(huì)導(dǎo)致整個(gè)熒光體激發(fā)態(tài)的衰減加快，熒光體熒光壽命減小.該體系熒光壽命通常用平均熒光壽命[15]表示，

τ=τ1α1+τ2α2+τ3α3

(2)

式中，τ為平均熒光壽命；τi和αi分別是i次擬合對(duì)應(yīng)的延遲時(shí)間和相對(duì)強(qiáng)度.

計(jì)算得到LYZ-TBHQ體系不同濃度下的熒光壽命如表1所示.

表1 不同TBHQ濃度對(duì)應(yīng)的LYZ熒光壽命

表1數(shù)據(jù)顯示，隨著體系中TBHQ濃度的增加，LYZ熒光壽命出現(xiàn)輕微降低，降幅小于1%.據(jù)此可以判定，TBHQ對(duì)LYZ內(nèi)源熒光的猝滅遵循靜態(tài)猝滅機(jī)理，TBHQ通過(guò)與LYZ結(jié)合形成了復(fù)合物.

2.2 TBHQ對(duì)LYZ的結(jié)合特性分析

2.2.1 結(jié)合強(qiáng)度.

當(dāng)TBHQ對(duì)LYZ的猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅時(shí)，假定小分子配體TBHQ在LYZ上有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，那么熒光強(qiáng)度、猝滅劑的濃度與結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)之間的關(guān)系符合雙對(duì)數(shù)方程，即修正的Stern-Volmer方程，也稱為雙對(duì)數(shù)曲線[12]，

log(F0-F)/F=logKa+nlog[Q]

(3)

式中，Ka(截距)為TBHQ與LYZ的結(jié)合常數(shù)；n(斜率)表示結(jié)合位點(diǎn)數(shù).

不同溫度下，TBHQ與LYZ相互作用的計(jì)算結(jié)果如表2所示.

表2 不同溫度下TBHQ和LYZ相互作用體系中的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

表2數(shù)據(jù)表明，TBHQ能與LYZ形成較強(qiáng)的結(jié)合，結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而降低.TBHQ與LYZ的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)大約為1，隨測(cè)試溫度的改變，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)無(wú)明顯變化.

2.2.2 熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合力類型的確定.

通常情況下，有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)間的相互作用力可能包括靜電作用力、氫鍵作用、范德華力和疏水作用，具體可由熱力學(xué)參數(shù)如焓變、吉布斯自由能變化和熵變的正負(fù)性和大小進(jìn)行判斷.由Van't Hoff方程和Gibbs-Helmholtz 方程，可根據(jù)不同溫度下結(jié)合常數(shù)的變化計(jì)算得到TBHQ與LYZ的相互作用熱力學(xué)參數(shù)為，

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中，T為實(shí)驗(yàn)溫度，Ka為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為摩爾氣體常數(shù)，ΔH為相互作用體系焓變，ΔS為體系熵變，ΔG為體系的吉布斯函數(shù).

有研究認(rèn)為，當(dāng)ΔH<0或ΔH≈0而ΔS>0時(shí)，主要作用力為靜電作用力；當(dāng)ΔH<0且ΔS<0時(shí)，主要作用力為范德華力或氫鍵作用；當(dāng)ΔH>0且ΔS>0時(shí)，主要作用力為疏水性作用[16].表2數(shù)據(jù)顯示，ΔG為負(fù)值，表明TBHQ和LYZ的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程，且ΔH和ΔS在此溫度范圍內(nèi)保持負(fù)值，說(shuō)明TBHQ與LYZ的主要相互作用力為氫鍵作用和范德華力.

2.3 TBHQ對(duì)LYZ構(gòu)象及氨基酸殘基微環(huán)境的影響

利用同步熒光法的優(yōu)勢(shì)在于該法可以將普通熒光光譜內(nèi)源性熒光生色團(tuán)的重疊發(fā)射峰區(qū)分開來(lái).Δλ=15 nm 時(shí)，表現(xiàn)Tyr的特征同步熒光峰；Δλ=60 nm時(shí)，則會(huì)表現(xiàn)Trp的特征同步熒光峰[16].為了闡明LYZ-TBHQ體系中，熒光生色團(tuán)中的酪氨酸和色氨酸殘基到底發(fā)生了怎樣的變化，本研究進(jìn)行了同步熒光實(shí)驗(yàn)，Δλ固定在15 nm和60 nm時(shí)對(duì)應(yīng)的同步熒光譜圖如圖3所示.

圖3 TBHQ-LYZ體系同步熒光光譜及三維熒光曲面等高線圖

圖3顯示，隨著TBHQ的濃度增加，LYZ熒光強(qiáng)度降低，說(shuō)明TBHQ同時(shí)猝滅了色氨酸與酪氨酸殘基發(fā)射的熒光.Δλ固定為60 nm時(shí),可以看到熒光強(qiáng)度降低且伴隨著峰位藍(lán)移，暗示著色氨酸殘基所處微環(huán)境極性減小或疏水性增加.而Δλ固定為15 nm時(shí)，峰位未發(fā)生明顯移動(dòng).同步熒光結(jié)果證明TBHQ在LYZ上的結(jié)合位置應(yīng)當(dāng)更靠近色氨酸殘基.

而在LYZ的三維熒光曲面圖中，激發(fā)波長(zhǎng)225 nm處(左)波形由色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)射熒光引起，約280 nm處(右)的峰則為為多肽骨架出峰[17].圖3(C)、(D)分別為L(zhǎng)YZ和LYZ-TBHQ體系的三維熒光.據(jù)該譜圖顯示，因TBHQ的加入，色氨酸與酪氨酸殘基峰的強(qiáng)度明顯降低，而多肽骨架峰則出現(xiàn)了輕微的增強(qiáng).表明該體系中，TBHQ與LYZ的結(jié)合對(duì)LYZ中色氨酸和酪氨酸殘基影響相對(duì)較顯著，而對(duì)LYZ多肽骨架僅顯示了輕微的干擾，LYZ的整體構(gòu)象仍保持完整.

3 結(jié) 論

本研究表明，熒光光譜法是探討食品抗氧化劑TBHQ與LYZ結(jié)合特性的一種有效方法.研究結(jié)果顯示，酚類食品抗氧化劑TBHQ能與LYZ形成不發(fā)光的基態(tài)復(fù)合物，結(jié)合常數(shù)數(shù)量級(jí)處于在104的中等級(jí)別，氫鍵作用和范德華力主導(dǎo)這一自發(fā)結(jié)合過(guò)程，且該結(jié)合過(guò)程會(huì)導(dǎo)致LYZ的氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變，且LYZ的整體構(gòu)象仍保持完整，但其具體結(jié)合位置尚需進(jìn)一步研究.本研究結(jié)果有助于在分子水平上理解酚類食品抗氧化劑進(jìn)入生物體后，LYZ對(duì)其的攜帶和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程.