優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的葡萄酒釀造應(yīng)用潛力

陳景樺， 馬小琛， 李 婷， 胡朱瑞， 鄧凱瑞， 陶永勝,2，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心， 陜西 楊凌 712100)

非釀酒酵母和釀酒酵母普遍存在于葡萄、釀酒設(shè)備和酒窖環(huán)境中，其中葡萄是酵母菌的主要來源。無論是自然發(fā)酵還是接種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，釀酒酵母因其較高的酒精轉(zhuǎn)化率和酒精耐受性能夠保證發(fā)酵的順利進(jìn)行和完成。非釀酒酵母，酒精轉(zhuǎn)化率低、酒精和SO2耐受性較差，一般在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生較高的揮發(fā)酸，引起葡萄酒風(fēng)味的不良變化，因此最初被認(rèn)為是導(dǎo)致葡萄酒破敗的酵母[1-2]。近年來，通過非釀酒酵母與釀酒酵母的混合酒精發(fā)酵，研究人員開始重新評價優(yōu)選非釀酒酵母在葡萄酒釀造過程中的作用，越來越多的研究者開始關(guān)注非釀酒酵母生成的代謝產(chǎn)物對葡萄酒風(fēng)味的影響[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，與釀酒酵母相比，一些優(yōu)選非釀酒酵母具有較高的糖苷酶活性，能夠在酒精發(fā)酵過程中促進(jìn)葡萄香氣糖苷的水解，增加葡萄酒典型的品種香氣[5]。另有一些非釀酒酵母在發(fā)酵過程中能夠表現(xiàn)出較高的酯酶活性，調(diào)節(jié)葡萄酒中酯類的平衡，從而增加葡萄酒的果香特征[6-7]。另有研究得出，非釀酒酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵過程中生成的主要副產(chǎn)物，甘油、揮發(fā)酸、琥珀酸和乳酸等能夠影響葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量。其中，甘油能夠提高葡萄酒的黏稠度，影響葡萄酒的口感和甜度[8]；揮發(fā)酸、琥珀酸和乳酸是酵母代謝過程中生成的重要酸，不僅影響葡萄酒的酸感和平衡，還會增加葡萄酒的風(fēng)味[9]，是評價優(yōu)選非釀酒酵母釀造特性的客觀依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)菌株為發(fā)酵畢赤酵母，該菌株與釀酒酵母在混合發(fā)酵過程中酯酶活性較高，能夠增加葡萄酒中酯類物質(zhì)的含量[10]。本實(shí)驗(yàn)通過模擬葡萄汁的發(fā)酵研究優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵過程中乙醇、甘油、琥珀酸、乳酸和揮發(fā)酸的生成動力學(xué)，從而較全面的評價其與釀酒酵母混合發(fā)酵對葡萄酒感官質(zhì)量的影響，為實(shí)現(xiàn)該酵母在葡萄酒釀造生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌種材料

菌株為川南白酒窖池中分離得到的發(fā)酵畢赤酵母Z9Y-3，Pichiafermentans，以下簡稱P.F；法國Laffort葡萄酒輔料公司的Actiflore F33商業(yè)釀酒酵母，Saccharomycescerevisiae，以下簡稱S.C。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵畢赤酵母與商業(yè)釀酒酵母F33的菌落形態(tài)特征如表1。

表1 酵母的菌落形態(tài)

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

D-葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨、氫氧化鈉、鹽酸、次甲基藍(lán)、酚酞、EDTA-Na、硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸錳、高碘酸鈉、丙三醇、七水合硫酸鎂、一水合檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、鼠李糖、乙酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮，均為分析純，四川西隴化工股份有限公司。乙酸、乳酸、琥珀酸、磷酸、磷酸二氫鈉，均為色譜純，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TGL- 16M型臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KH- 500DE型數(shù)控超聲波清洗器，中國禾創(chuàng)儀器有限公司；GB85DA型滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；MP- 250B型霉菌培養(yǎng)箱，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；HH- S6型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；DGX- 9243BC型鼓風(fēng)干燥箱，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；NRY- 1102C型全溫?fù)u床，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；BX51型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；LC- A10型高效液相色譜儀，中國島津管理有限公司。

1.4 模擬發(fā)酵汁的配方

模擬發(fā)酵汁的制作參考Contreras等[11]的方法，稍有修改。葡萄糖100 g/L，果糖100 g/L，酵母浸粉1 g/L，硫酸銨2 g/L，檸檬酸0.3 g/L，蘋果酸5 g/L，酒石酸5 g/L，七水合硫酸鎂0.4 g/L，磷酸二氫鉀5 g/L，氯化鈉 0.2 g/L，硫酸錳 0.05 g/L，pH值調(diào)至3.5。

1.5 培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)菌株于YEPD培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)48 h，活化好的菌株再于擴(kuò)增培養(yǎng)基28 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)72 h，最后將培養(yǎng)好的菌株按照106CFU/mL細(xì)胞濃度接種于模擬葡萄汁中啟動發(fā)酵。

1.6 混合發(fā)酵接種方案

設(shè)計4組不同的模擬葡萄汁酒精發(fā)酵處理方案。1)對照組：僅接種菌液濃度為2×106CFU/mL釀酒酵母或發(fā)酵畢赤酵母進(jìn)行單一發(fā)酵。2)實(shí)驗(yàn)組：S0組為同時接種菌液濃度為1×106CFU/mL的釀酒酵母和發(fā)酵畢赤酵母；S48組為提前接種1×106CFU/mL發(fā)酵畢赤酵母，48 h后接種1×106CFU/mL釀酒酵母。模擬發(fā)酵為22 ℃恒溫靜止發(fā)酵，每隔24 h取樣。

1.7 酵母數(shù)量測定

模擬發(fā)酵體系取樣前搖瓶，使沉淀的菌體均勻分布在發(fā)酵液中，每隔24 h于發(fā)酵液中取一定體積模擬酒樣。利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接觀察計數(shù)測定酵母總數(shù)[12]。利用平板計數(shù)法觀察記錄菌落數(shù)，對不同發(fā)酵處理下酵母生長情況進(jìn)行監(jiān)測。

1.8 指標(biāo)的測定

還原糖含量采用斐林試劑法[12]；乙醇采用密度瓶法[12]；揮發(fā)酸采用水蒸氣蒸餾法，以醋酸計[12]；甘油采用高碘酸鈉氧化法[13]；琥珀酸、乳酸采用高效液相色譜法[14]。

1.9 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Origin Pro 8.5完成。

2 動力學(xué)模型的建立

2.1 菌體生長動力學(xué)模型

通過Logistic方程來建立菌體生長動力學(xué)模型，對酵母生長進(jìn)行非線性擬合[15]，見式(1)。

(1)

t為發(fā)酵時間，d；X為t時刻菌體濃度，CFU/mL；Xm為最大菌體濃度，CFU/mL；k為最大比生長速率，d-1。

2.2 底物消耗動力學(xué)模型

利用Luedeking-Piret方程建立底物消耗動力學(xué)模型，對底物消耗進(jìn)行非線性擬合[15]，見式(2)。

(2)

2.3 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型

利用Luedeking-Piret方程建立產(chǎn)物生成動力學(xué)模型，對生成的產(chǎn)物進(jìn)行非線性擬合[16]，見式(3)。

(3)

式(3)中，Y為產(chǎn)物產(chǎn)量，g/L；Y0為產(chǎn)物最初含量，g/L；t為發(fā)酵時間，d-1；Xt為t時刻菌體濃度，CFU/mL；ɑ為產(chǎn)物生長偶聯(lián)參數(shù)；β為非生長偶聯(lián)參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 酵母生長動力學(xué)模型分析

對4組不同模擬葡萄汁酒精發(fā)酵過程中兩種酵母的生長情況進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見圖1。

混合發(fā)酵處理的酵母生長動力學(xué)見圖1。圖1(a，b，c)為混合酒精發(fā)酵過程中活菌數(shù)的生長情況，生長周期為16 d，圖1(d)為不同發(fā)酵處理的總酵母數(shù)，待酒精發(fā)酵結(jié)束測定了18 d。發(fā)酵畢赤酵母和釀酒酵母很快進(jìn)入對數(shù)期，分別于第7天和第8天后進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵畢赤酵母的菌體生長速率低于釀酒酵母。同時接種混合發(fā)酵2 d后，發(fā)酵畢赤酵母活菌數(shù)接近釀酒酵母，酵母濃度達(dá)到最大值(0.89×106CFU/mL)后開始下降，第4天消失，釀酒酵母活菌數(shù)第8天達(dá)到最大值(5.2×107CFU/mL)后進(jìn)入穩(wěn)定期。順序接種混合發(fā)酵10 d后釀酒酵母進(jìn)入穩(wěn)定期，活菌數(shù)達(dá)到最大值(7×107CFU/mL)，發(fā)酵畢赤酵母活菌數(shù)第4天達(dá)到最大值(2.1×107CFU/mL)，第7天消失。與釀酒酵母相比，順序接種混合發(fā)酵釀酒酵母的對數(shù)生長期延長2 d，酵母總菌數(shù)第10天達(dá)到最大值(7.6×107CFU/mL)后進(jìn)入穩(wěn)定期，且酵母總菌數(shù)最高。

圖1 不同模擬發(fā)酵中兩種酵母的生長變化情況Fig.1 Growth of two yeasts in different model fermentations

圖2 不同模擬發(fā)酵體系中還原糖和乙醇的變化情況Fig.2 Variation of reducing sugar and alcohol contents during different model fermentations

3.2 還原糖消耗動力學(xué)模型分析

混合發(fā)酵處理的底物消耗動力學(xué)見圖2。3種不同接種處理發(fā)酵結(jié)束時殘?zhí)欠秶?.8～2.5 g/L，發(fā)酵畢赤酵母單一發(fā)酵終止時殘?zhí)菫?40 g/L，還原糖消耗速率最慢。發(fā)酵畢赤酵母酒精發(fā)酵過程中乙醇增長緩慢，發(fā)酵結(jié)束時生成的乙醇含量最低，約為φ=4.6 %。混合發(fā)酵過程中生成的乙醇含量略高于釀酒酵母，其中同時接種處理發(fā)酵生成的乙醇含量最高，約φ=13.6%。

模擬發(fā)酵中酵母生長動力學(xué)參數(shù)結(jié)果也見表2，各酵母生長模型的R2在0.93～0.95，擬合度較高，能夠較好地反映模擬葡萄汁發(fā)酵過程中酵母的生長規(guī)律。其中釀酒酵母發(fā)酵和發(fā)酵畢赤酵母的各項發(fā)酵參數(shù)(Xm，B，k)相差較大，說明兩種酵母在發(fā)酵過程中的生長模型完全不同。對于混合發(fā)酵而言，同時接種與釀酒酵母發(fā)酵的酵母生長模型較為接近，而順序接種發(fā)酵模式下的酵母生長模型與釀酒酵母發(fā)酵存在明顯區(qū)別。模擬葡萄汁還原糖消耗和乙醇生成動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表2，不同發(fā)酵處理下還原糖消耗模型的R2達(dá)到0.99，乙醇生成模型的R2在0.96～0.98，擬合度較高，能夠較好地反映模擬葡萄汁發(fā)酵過程中還原糖消耗和乙醇的生成情況。其中釀酒酵母和發(fā)酵畢赤酵母的各項發(fā)酵參數(shù)(ɑ，β)相差較大，說明兩種酵母在發(fā)酵過程中的還原糖消耗和乙醇生成模型完全不同。對于混合發(fā)酵而言，同時接種與順序接種發(fā)酵模式下的還原糖消耗和乙醇生成模型與釀酒酵母發(fā)酵較為接近。

由不同發(fā)酵體系中酵母生長、糖消耗和乙醇生成的動力學(xué)結(jié)果分析可知，混合發(fā)酵過程中優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母的活動不會影響酒精發(fā)酵的順利進(jìn)行和發(fā)酵完全。

表2 不同模擬葡萄汁混合發(fā)酵過程中酵母生長、糖消耗和乙醇生成動力學(xué)參數(shù)

Tab.2 Kinetic parameters of yeasts growth, sugar consumption and alcohol production during different model fermentations

項目相關(guān)參數(shù)組別S.C組P.F組S0組S48組酵母Xm/(106CFU·mL-1)6.7044.2618.1168.780生長B4.67422.67016.30145.919K0.5150.8240.8940.826R20.9530.9150.9380.942還原糖ɑ13.43432.6667.5085.481β0.7002.2120.9501.113R20.9920.9730.9940.999乙醇ɑ0.5100.1751.3751.147β0.0970.2950.1250.115R20.9540.9830.9840.983

3.3 主要副產(chǎn)物生成動力學(xué)模型分析

圖3 不同模擬葡萄汁混合發(fā)酵體系中主要副產(chǎn)物生成情況Fig.3 Production of main by-products during different model fermentations

混合發(fā)酵處理的主要副產(chǎn)物生成動力學(xué)見圖3。發(fā)酵畢赤酵母酒精發(fā)酵過程中甘油增長緩慢，生成的甘油含量最低，約1.55 g/L。釀酒酵母和同時接種處理混合發(fā)酵過程中甘油不斷增加，第10天增速開始變緩?；旌习l(fā)酵過程中生成的甘油含量略高于釀酒酵母，其中順序接種處理生產(chǎn)的甘油含量最高，約2.74 g/L。釀酒酵母和發(fā)酵畢赤酵母發(fā)酵過程中揮發(fā)酸增長較快，最終的揮發(fā)酸含量為0.41、0.35 g/L。同時接種處理生成的揮發(fā)酸含量不斷增加，第8天趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時揮發(fā)酸濃度為0.28 g/L。順序接種處理發(fā)酵過程中生成的揮發(fā)酸含量不斷增加，第10天趨于穩(wěn)定?；旌习l(fā)酵處理過程中生成的揮發(fā)酸含量低于單發(fā)酵，尤其是順序接種處理，約0.21 g/L。發(fā)酵過程中生成的琥珀酸呈先增后降的趨勢。發(fā)酵畢赤酵母生成的琥珀酸含量不斷增加，第8天達(dá)到最大值(0.74 g/L)，隨后開始下降，發(fā)酵結(jié)束時琥珀酸濃度為0.41 g/L。釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中琥珀酸的增長緩慢，第9天達(dá)到最大值0.47 g/L。同時接種和順序接種處理發(fā)酵過程中琥珀酸的增長速率接近，第9天達(dá)到最大值(0.58、0.76 g/L)后開始下降，其中順序接種處理最終的琥珀酸含量最低0.20 g/L。發(fā)酵過程中生成的乳酸含量呈先增后降的趨勢。釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中乳酸增長較快，第8天達(dá)到最大值0.42 g/L。同時接種處理發(fā)酵過程中生成的乳酸含量不斷增加，第8天達(dá)到最大值(0.28 g/L)后開始下降，最終的乳酸含量為0.12 g/L。順序接種處理在發(fā)酵過程中乳酸含量不斷增加，第10天乳酸含量達(dá)到最大值(0.3 g/L)后開始下降，發(fā)酵結(jié)束時乳酸含量為0.13 g/L?；旌习l(fā)酵過程中生成的乳酸含量略低于釀酒酵母。

主要副產(chǎn)物生成動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表3，不同發(fā)酵處理下主要副產(chǎn)物生成模型的R2在0.96～0.99，擬合度較高，能夠較好地反映模擬葡萄汁發(fā)酵過程中主要副產(chǎn)物的生成規(guī)律。其中，甘油生成動力學(xué)結(jié)果表示，釀酒酵母和發(fā)酵畢赤酵母發(fā)酵的各項發(fā)酵參數(shù)(ɑ，β)相差較大，說明兩種酵母在發(fā)酵過程中甘油生成模型完全不同。對于混合發(fā)酵而言，同時接種與順序接種發(fā)酵模式下的甘油生成模型與釀酒酵母發(fā)酵較為接近。結(jié)合混合酒精發(fā)酵過程中，琥珀酸和乳酸先增后降的變化趨勢，對混合酒精發(fā)酵過程中琥珀酸和乳酸前期生長的情況進(jìn)行非線性擬合。揮發(fā)酸、琥珀酸和乳酸動力學(xué)結(jié)果表示，不同發(fā)酵處理的各項發(fā)酵參數(shù)(ɑ，β)相差較大，說明不同接種處理發(fā)酵過程中揮發(fā)酸、琥珀酸和乳酸的生成模型完全不同。

表3 不同模擬葡萄汁混合發(fā)酵中主要副產(chǎn)物的生成動力學(xué)參數(shù)

結(jié)合主要副產(chǎn)物生成動力學(xué)結(jié)果分析，與釀酒酵母單發(fā)酵相比，混合發(fā)酵生成的琥珀酸和乳酸含量基本不變，揮發(fā)酸略有降低，甘油含量增加，說明優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對葡萄酒的酸感影響不明顯，但能夠增加甘油的含量，從而可以提高葡萄酒的酒體圓潤度。

4 討論與結(jié)論

受消費(fèi)者對葡萄酒風(fēng)味多樣化需求的影響，非釀酒酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵及其接種策略的研究已成為當(dāng)前葡萄酒風(fēng)味調(diào)控的焦點(diǎn)。Nissen等[17]研究發(fā)現(xiàn)，兩種非釀酒酵母(戴爾凱氏有孢圓酵母Torulasporadelbrueckii和克魯維耐熱酵母Kluyveromycesthermotolerans)純發(fā)酵時酵母對數(shù)期的生長速率與釀酒酵母較為一致，而穩(wěn)定期的酵母數(shù)量低于釀酒酵母。Sadineni等[18]發(fā)現(xiàn)美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)與釀酒酵母同時接種對釀酒酵母的生長影響不明顯，而戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合接種發(fā)酵時，隨著接種比例增加，能夠影響釀酒酵母的生長代謝。Rodríguez等[19]發(fā)現(xiàn)順序接種(96 h)混合發(fā)酵過程中釀酒酵母的數(shù)量低于單一釀酒酵母，但酵母總數(shù)高于釀酒酵母純發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同時接種處理的釀酒酵母數(shù)量略低于單一釀酒酵母，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母第4天開始衰亡至無法檢出，而順序接種處理的釀酒酵母在第5～6天開始占主導(dǎo)地位，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母存活時間更長(7 d)，酵母總數(shù)最多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究不同，其原因可能是從川南白酒窖池中優(yōu)選得到的發(fā)酵畢赤酵母，長期處于白酒的釀造環(huán)境中，形成不同的生長特性。

葡萄酒中乙醇的含量范圍φ=8%～16%，影響葡萄酒的熱感、酒體和黏稠度，同時還會影響葡萄酒風(fēng)味化合物的感知度，近年來優(yōu)選非釀酒酵母作為潛在的控制葡萄酒酒精度的工具受到強(qiáng)烈關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[17-19]一些酒精耐受性較高的非釀酒酵母(φ=10.5%～12.5%)，如季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniasporaguillicrmondii)、戴爾有孢圓酵母和克魯維耐熱酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵釀造的葡萄酒酒精含量均低于釀酒酵母純發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同時接種優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母混合發(fā)酵積累的乙醇與釀酒酵母純發(fā)酵相比稍有增加。

甘油，作為酵母代謝第二大產(chǎn)物，甘油的存在有利于增強(qiáng)葡萄酒的圓潤感和甜度，并有助于提高葡萄酒香氣和風(fēng)味的復(fù)雜性[8]。有研究表明，星形假絲酵母(Candidastellata)所釀造的葡萄酒中甘油含量可高達(dá)14 g/L，并且與釀酒酵母順序接種發(fā)酵對葡萄酒化學(xué)成分和感官特征產(chǎn)生的影響比同時接種發(fā)酵更為明顯[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵畢赤酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵也能夠顯著提高葡萄酒中甘油的含量[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母順序接種發(fā)酵生成的甘油含量高于釀酒酵母純發(fā)酵(7%)，說明延遲接種釀酒酵母來支持優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母菌株的生長，能夠提高發(fā)酵過程中甘油的生成，對提高葡萄酒質(zhì)量有積極影響。

乙酸占葡萄酒總揮發(fā)酸的90%以上，是酒精發(fā)酵中定量評價和感官分析最重要的揮發(fā)酸，其含量范圍在0.2～1.1 g/L，隨著乙酸濃度的增加，葡萄酒表現(xiàn)出醋味，釀酒酵母產(chǎn)乙酸含量約0.3 g/L，而非釀酒酵母發(fā)酵過程中往往會產(chǎn)生較高的揮發(fā)酸[20-21]。但是，一些混菌共發(fā)酵研究表明，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些揮發(fā)酸含量降低的葡萄酒[22-23]。Lachanceathermotolerans與釀酒酵母的順序發(fā)酵中，揮發(fā)酸含量低于0.3 g/L[24]。Jemec等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，酒精轉(zhuǎn)換率較低的葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，產(chǎn)乙酸含量高(0.8～2.5 g/L)，在與釀酒酵母同時接種發(fā)酵的葡萄酒中乙酸的含量卻降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵過程中生成的揮發(fā)酸含量略低于釀酒酵母純發(fā)酵，尤其是順序接種，不會對葡萄酒香氣產(chǎn)生負(fù)面影響。

葡萄酒中主要的有機(jī)酸是酒石酸，其次是蘋果酸，它們從酸感上支撐葡萄酒的酒體。酒石酸在葡萄酒中的含量較為穩(wěn)定，酒精發(fā)酵過程中酵母一般不代謝酒石酸和蘋果酸。琥珀酸和乳酸是發(fā)酵過程中酵母代謝產(chǎn)生的主要有機(jī)酸，引起酸感變化，過多的琥珀酸還會給葡萄酒帶來不尋常的咸味和苦味[9]。最近研究表明，東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)純發(fā)酵生成的琥珀酸含量相對較高，但其與釀酒酵母順序接種后的混合發(fā)酵生成的琥珀酸含量較低，葡萄酒口感平衡，果香較好[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)選菌株混合發(fā)酵處理中琥珀酸含量無明顯增高，并且順序接種處理比釀酒酵母純發(fā)酵中琥珀酸的含量略有降低，說明優(yōu)選酵母混合發(fā)酵不會增加琥珀酸的含量，避免葡萄酒出現(xiàn)明顯的咸味和苦味。乳酸具有宜人的酸性風(fēng)味，但酒精發(fā)酵過程中僅能積累微量的乳酸。有研究發(fā)現(xiàn)星型假絲酵母與釀酒酵母同時接種混合發(fā)酵生成的乳酸含量會有所增加[20]，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵不影響葡萄酒中乳酸的含量。

綜上，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母和釀酒酵母混合酒精發(fā)酵過程中乙醇、甘油、琥珀酸、乳酸和揮發(fā)酸的生成與酵母菌體生長同步，酒精發(fā)酵中酵母生長總量達(dá)到穩(wěn)定期時(6～10 d)，混合發(fā)酵過程中生成的乙醇、甘油、琥珀酸、乳酸和揮發(fā)酸達(dá)到最大值。與釀酒酵母相比，順序接種混合發(fā)酵中琥珀酸和乳酸含量基本不變，揮發(fā)酸含量略有降低，甘油含量增加，說明優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對葡萄酒的酸感影響不明顯，但甘油的增加能夠改善葡萄酒的酒體質(zhì)量。結(jié)合前期優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的增香潛力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該株發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵具有葡萄酒釀造的應(yīng)用價值。