新型重組H7N9禽流感研究進展

趙俊杰，王團結(jié)，姚文生，康凱，陳耀星，徐和敏，張乾義*，何偉勇*

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；3. 中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100067)

2013年3月，一場嚴重的致人呼吸道疾病的傳染病從上海和安徽開始爆發(fā)。3月31日，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會對外宣布，上海和安徽爆發(fā)致人死亡的病原體為新型的H7N9禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)。緊接著OIE/國家禽流感參考實驗室立即緊急組織有關(guān)專家在上海和安徽的家禽養(yǎng)殖場和活禽市場采集樣品約1000余份，進行活禽交易市場H7N9亞型AIV的鑒定和分離。在上?；钋菔袌霾杉诫u、鴿、鴨和環(huán)境中H7N9樣品陽性率分別為6.67%、8.57%、0和10.77%。隨后，在3月31日到5月2日期間，禽流感研究專家在安徽、上海、江蘇、浙江、湖北、山東、河南、江西、廣東、福建和湖南等地進行緊急檢測采樣，共采集樣品10703份，通過病毒亞型鑒定和序列分析，發(fā)現(xiàn)了52株H7N9亞型AIV。研究人員對人H7N9 AIV可能的感染源進行快速確定，其中來自活禽市場的雞和環(huán)境中檢測到的H7N9 AIV數(shù)量最多，分別為31和13，占到此次采樣發(fā)現(xiàn)的陽性樣本總數(shù)的84.62%。此后，H7N9 AIV在國內(nèi)一直呈現(xiàn)散發(fā)狀態(tài)。截至2018年3月，內(nèi)地共報告1438例人感染H7N9禽流感確診病例，死亡570例，病死率為39.63%。

1 H7N9病毒的生物學特性和遺傳學分析

AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬[1]，病毒粒子呈多形性，主要以球形為主，是單股負鏈分節(jié)段的RNA病毒。其基因組分8個片段，主要編碼核蛋白復合體(RNPc)PB1、PB2、PA和NP，表面結(jié)構(gòu)蛋白HA(血凝素)、NA(神經(jīng)氨酸酶)，基質(zhì)蛋白M，非結(jié)構(gòu)蛋白NS[2]。HA和NA是流感病毒的表面抗原糖蛋白，具有良好的免疫原性，同時又有很強的變異性，也是病毒血清亞型及毒株分類的重要依據(jù)。根據(jù)病毒HA和NA的抗原性不同，可以將A型流感病毒分為16個H亞型(H1-H16)和10個N(N1-N10)亞型，兩者組合形成眾多血清亞型，已證實能感染人類的AIV有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、H5N2和H10N7等。根據(jù)AIV毒力強弱，將其分為高致病性毒株和低致病性毒株兩大類[3]，只有H5和H7亞型高致病力病毒對家禽高度致死。但是，所有亞型病毒都可能獲得感染人的能力并引起公共衛(wèi)生危機。

動物流感引起人流感的機制之一，是多宿主(包括人)流感病毒的重組。研究表明，H7N9亞型AIV來源于不同亞型的AIV之間發(fā)生的多次重配。病毒的HA基因可能來自于2011年浙江分離到的感染鴨H7N9 AIV，NA基因可能來自于早期分離的鴨H4N9 AIV和鴨H11N9 AIV，病毒的其他內(nèi)部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)來自于兩種不同的H9N2亞型AIV[4]，其中NS基因來源于江蘇地區(qū)雞群H9N2亞型病毒，其余內(nèi)部基因來源于上海等地雞群H9N2亞型病毒[5]。

H7N9亞型AIV感染人表現(xiàn)為嚴重呼吸道癥狀，病情嚴重，因此尋找使人類感染并且導致嚴重疾病的突變至關(guān)重要。通過對7株H7N9病毒的受體特異性測試發(fā)現(xiàn)，盡管有些病毒仍然保持識別禽類受體成分的能力，但所有測試病毒都已獲得結(jié)合人類受體成分的能力。小鼠研究表明，H7N9 禽分離株對小鼠無致病力，人分離株引起小鼠嚴重發(fā)病甚至死亡，提示H7N9病毒在人體復制時獲得關(guān)鍵氨基酸位點突變使其致病力增強。H7N9 AIV HA蛋白發(fā)生了Q226L、G186V突變，使得病毒更容易與人呼吸道上皮細胞受體的α 2,6-半乳糖苷鍵連接的唾液酸結(jié)合[6-7]，從而獲得在人上呼吸道復制的能力；此外，HA受體結(jié)合區(qū)發(fā)生了T160A突變，使病毒與α 2,3-半乳糖苷鍵的結(jié)合能力減弱，相對增強了其與人體受體的結(jié)合能力[8]。NA蛋白可分為頭部、頸部、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)四個區(qū)。H7N9 AIV NA蛋白頸部區(qū)69-73位缺失了5個氨基酸，這種缺失提高了H7N9病毒感染陸棲鳥類、家禽和哺乳動物的能力[9]。此外，PB2基因發(fā)生了E627K和D701N突變，研究人員證明這些突變導致聚合酶活性增強并使病毒感染哺乳動物的能力增強[10]。NS1序列失去了C-端PDZ結(jié)合基序，可能使病毒在哺乳動物中的適應性減弱，但NS1蛋白P42S的突變使病毒對老鼠的毒性增強[11]。M1蛋白N30D和T215A突變增加了對老鼠的毒性[12]。M2蛋白S31N突變降低了對金剛烷胺和金剛乙胺的敏感性[13]。在NA蛋白中，耐藥突變R294K和H276Y發(fā)生在少數(shù)菌株中[14]。以上這些突變都大大增加了新型重組H7N9亞型AIV對哺乳動物的致病性及其在不同宿主之間的傳播能力，并且會造成其耐藥性的產(chǎn)生。

Zhang等證實，部分人源和禽源的H7N9 AIV的分離株已經(jīng)獲得了在雪貂間通過呼吸道液滴飛沫傳播的能力，說明新型的H7N9 AIV已經(jīng)能夠識別人類受體，且人源分離株會引起小鼠嚴重發(fā)病并導致死亡[4]。更重要的是，H7N9病毒可在雪貂間通過呼吸道飛沫傳播，暗示H7N9禽流感發(fā)生人際傳播的可能性極大。研究人員證實，高致病性H7N9病毒在雪貂肺中比低致病性H7N9病毒更難清除，這可能是導致其致病性不同的重要原因之一[15]。病毒H7N9 AIV一直在禽類中流行并不斷發(fā)生進化重組，而感染人的H7N9 AIV發(fā)生了重要變異且有毒力返強的現(xiàn)象。如果禽源H7N9病毒與人源H7N9病毒發(fā)生混合感染，使其獲得人類流感病毒的關(guān)鍵基因，其適應人類并在全世界流行的概率是極大的[16]。

2 H7N9禽流感的流行病學調(diào)查

有文獻表明世界范圍內(nèi)有過H1、H2、H3和H5亞型的流感的大流行，其中發(fā)生在1918年的西班牙流感曾造成5000萬人的死亡，2009年的墨西哥流感也曾肆虐全球，但這兩次流感的由來都懷疑和豬群中流行的豬流感有關(guān)。從2013年3月16日發(fā)現(xiàn)第一例感染H7N9病毒的患者到2013年5月底，在兩個多月的時間內(nèi)導致130多人感染，說明該病毒已獲得人際水平傳播能力，當時病死率達到30%左右。此后，2014年、2015年、2016年人感染H7N9禽流感病例數(shù)分別為330、196、264，死亡數(shù)分別為135、92、73，病死率分別為40.91%、46.94%、27.65%。2017年，H7N9亞型禽流感疫情又有卷土重來的趨勢，根據(jù)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會疾病預防控制局發(fā)布的傳染病預防控制消息，2017年1月到2018年3月H7N9亞型禽流感疫情發(fā)生情況見表1。

表1 2017.1-2018.3全國人感染H7N9禽流感發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)、病死率統(tǒng)計表Tab 1 Statistics on the incidence and death number and case fatality rate of human infected H7N9 avian influenza during 2017.1-2018.3

流行病學研究證實，患者多為有過接觸活禽史的中老年男性。因為中國南方地區(qū)活禽交易市場管理混亂、衛(wèi)生條件差、經(jīng)營流轉(zhuǎn)粗放，加劇了H7N9亞型禽流感的傳播和擴散。AIV也可通過環(huán)境傳播，接觸病毒污染的水源等都可能導致感染。且H7N9禽流感主要爆發(fā)于秋、冬等季節(jié)，夏季發(fā)病較少，說明病毒比較適合在較低的氣溫里生存。根據(jù)目前的報道，江蘇有1例病例疑似父親傳給女兒，女兒接觸父親6 h后發(fā)病并最終相繼死亡。經(jīng)有關(guān)部門鑒定，兩人感染的病毒高度一致，提示此病可因密切接觸患者分泌物導致傳染，但目前還沒有證據(jù)顯示病毒在人與人之間發(fā)生了飛沫傳播。由于新型H7N9 AIV HA裂解位點為PKGRGLFG，表明其在禽類是低致病性的，因此新型H7N9亞型AIV可能在家禽中傳播而不表現(xiàn)任何的臨床癥狀，這種傳播極具隱蔽性，給H7N9 AIV的監(jiān)測和篩查帶來極大的困難，所以一旦造成大規(guī)模流行和爆發(fā)，相關(guān)部門的防控措施往往滯后，對人類的危險性很大。

3 H7N9病毒的致病機制

H7N9在人體內(nèi)引起嚴重和致命的呼吸系統(tǒng)疾病，許多感染H7N9病毒的人由于嚴重肺炎及其并發(fā)癥而死亡[17]，潛伏期一般在7 d以內(nèi)，一般從發(fā)病到死亡大概為14 d[18]。初期表現(xiàn)為流感樣癥狀，高熱、頭痛、咳嗽，伴有肌肉酸痛和全身不適。后病程加速，表現(xiàn)為以高度呼吸困難為特點的重癥肺炎，體溫大多持續(xù)在39 ℃以上。若治療不及時，會導致彌散性血管內(nèi)凝血、休克、多器官功能衰竭綜合征甚至死亡。胸部影像學檢查可見肺部雙側(cè)毛玻璃樣變和肺實變，肺紋理增粗，有的還可繼發(fā)胸腔積液或氣胸?；颊呒毙云谘鍢颖局校瑱z測到趨化因子和細胞因子IP-10、MIG、MIP-1β、MCP-1、IL-6、IL-8和IFN-α水平增高，這些釋放出的細胞因子和化學因子阻塞血管，病人出現(xiàn)典型的“細胞因子風暴”[19]，加速病程向危重程度轉(zhuǎn)化。但又有研究顯示，IL-1β和TNF-α的分泌有助于機體抵御H7N9的感染[20]；此外，住院患者可能繼發(fā)細菌感染，因此感染特別是耐藥菌感染也是致死原因之一。

4 H7N9流感的綜合防控措施

由于H7N9亞型禽流感對禽類的低致病性，感染禽類通常不導致明顯的臨床癥狀，但感染人類往往來勢迅猛、致病力強，所以對其監(jiān)測和防范成為農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生部門工作的重點和難點。疫苗免疫是預防H7N9亞型禽流感最有效的辦法。但是AIV變異速率快，不同亞型禽流感之間交叉保護性較低，給防控帶來極大的困難。

世界衛(wèi)生組織推薦A/Shanghai/2/2013(H7N9)和A/Anhui/1/2013(H7N9)作為H7N9亞型禽流感疫苗的候選株，但是世界范圍內(nèi)還沒有成熟的動物用或人用疫苗上市。有的新型疫苗還在不斷研發(fā)和實驗過程中。李媛媛等通過8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建了H7N9亞型病毒的救獲株rCK/53，進一步構(gòu)建出了疫苗候選株CK53/PR8，為研制相關(guān)疫苗提供了基礎(chǔ)[21]；單繼艷等構(gòu)建了表達密碼子優(yōu)化的H7N9病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)HA基因的DNA疫苗pVAH7，并將其作為DNA疫苗進行SPF雞的免疫保護效力評價，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pVAH7在細胞中具有良好的表達效果、對雞有良好的免疫保護作用[22]；Kong和Zhang等利用質(zhì)粒反向遺傳方法構(gòu)建了H7N9冷適應性疫苗，其中HA和NA基因來自于A/Anhui/1/2013(H7N9)，剩余6個病毒基因來自于A/Ann Arbor/6/60。然后通過實驗證實此疫苗在恒河猴、小鼠、雪貂和幾內(nèi)亞豬等動物體內(nèi)都可以產(chǎn)生大量的中和抗體，連續(xù)免疫兩次就可以完全保護H7N9病毒的攻擊[23]。

5 結(jié) 語

H7N9亞型禽流感作為重要的人獸共患病，國內(nèi)外研究人員在致病機制研究和綜合防控措施上已經(jīng)取得了重要的階段性研究進展。最新研究表明，H7N9 AIV在宿主體內(nèi)發(fā)生抗原漂移致使致病力有增強趨勢。尋找新型H7N9病毒的來源及人類感染途徑，并了解它們的大流行潛力將進一步提高我們對未來流行病的反應和減輕嚴重程度的能力[24]，是今后研究的重點。H7N9 AIV是否可以跨越物種障礙發(fā)生人際傳播、主要傳播途徑是什么、未檢測到的隱性帶毒的患者群有多大、是否會出現(xiàn)更多的耐藥性毒株等等，依舊是懸而未決的問題。事實證明，及時關(guān)閉活禽市場、全面完善的監(jiān)測計劃、不同禽種間的隔離措施都有助于減少疫情的爆發(fā)[25-26]；研制出安全性好并且高效的禽用疫苗并從源頭上減少H7N9流感病毒的發(fā)生，依然是今后流感科研工作的重中之重。