珠海市2011—2016年諾如病毒胃腸炎暴發(fā)疫情的分子流行病學(xué)研究

張麗榮 林毅雄 李紅霞 周蘭蘭 黃輝濤 魏泉德

諾如病毒(norovirus)也叫諾瓦克病毒(norwalk virus,NV),為單股正鏈RNA病毒,是引起急性非細(xì)菌性胃腸炎的一組無包膜病毒。屬于杯狀病毒科,根據(jù)病毒聚合酶和結(jié)構(gòu)蛋白(VP1)氨基酸序列差異,NV被分為7個(gè)基因群(GI～GVⅡ),GⅠ和GⅡ是造成人類感染的主要型別,基因群再分為不同的基因型［1］,而眾多基因型中,GⅡ4是2014年之前全世界范圍內(nèi)流行的最主要型別［2］,而在2014—2015年流行季GⅡ17成為優(yōu)勢(shì)株［3］,隨后有 GⅡ3、GⅡ17、GⅡ.p16-GⅡ.2等多種流行株出現(xiàn)。NV變異速度快,可通過點(diǎn)突變積累或基因重組而產(chǎn)生突變株或新毒株,一般每隔2～3年便會(huì)出現(xiàn)新的變異株,從而引發(fā)大流行。

NV在全球范圍廣泛分布,在我國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)及報(bào)道［5-6］。NV的傳播能力很強(qiáng)、不僅可通過糞-口途徑傳播,還可通過氣溶膠顆粒以及通過直接接觸被污染的物品傳播,因此,在學(xué)校、幼兒園、餐館、療養(yǎng)院、工地、公司、旅行團(tuán)等人群聚集的地方易發(fā)生聚集性或暴發(fā)疫情,NV疫情發(fā)生率存在地區(qū)差異,南方高于北方,沿海高于內(nèi)地,城市高于農(nóng)村。

近年來,NV感染情況較為嚴(yán)重,珠海市每年都有多起NV感染引起的暴發(fā)疫情。為更好地了解和掌握本地區(qū)NV病原特征和流行規(guī)律,進(jìn)行科學(xué)的預(yù)警和防制,對(duì)珠海市2011—2016年引起暴發(fā)疫情的NV進(jìn)行分子流行病學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011—2016年珠海市的56起急性NV胃腸炎暴發(fā)疫情病例肛拭子標(biāo)本,其中2011年3起,2012年7起,2013年9起,2014年5起,2015年14起,2016年18起,標(biāo)本總數(shù)共計(jì)576份,疫情主要發(fā)生在學(xué)校和幼兒園。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理:采集發(fā)病當(dāng)日的病例肛拭子標(biāo)本放入裝有2～3 ml無菌PBS緩沖液的Eppendorf管中冷藏于10℃以下,2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室并立刻開展檢測(cè),標(biāo)本置于漩渦振蕩器震蕩15 s混勻,取上清,4℃暫存。

1.2.2 RNA提取:使用QIAamp Virul RNA Mini Kit試劑盒提取病毒RNA,提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè):上海輝睿生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的NV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒,含GⅠ﹠Ⅱ型,實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè):從每起急性NV胃腸炎疫情的陽性標(biāo)本中,隨機(jī)選擇3～4份陽性標(biāo)本,做RTPCR檢測(cè)。分別針對(duì)NoV GⅠ和NoV GⅡ的ORF2衣殼蛋白區(qū)設(shè)計(jì)引物,引物序列詳見表1。RT-PCR擴(kuò)增試劑為TaKaRa One Step RNA PCR Kit,反應(yīng)體系總體積25 μl,反應(yīng)條件為:50℃反轉(zhuǎn)錄35 min；95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸60 s,35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果并切膠回收。

表1 NoV GⅠ/NoV GⅡ RT-PCR擴(kuò)增引物Tab.1 RT-PCR primer sequenses for NoV GⅠ/NoV GⅡdetection

1.3 核苷酸序列測(cè)定和分析 因同一起疫情的標(biāo)本檢出的型別相同,故每起疫情選1株共計(jì)56株做種系進(jìn)化分析,RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。序列結(jié)果用Clustal X、DNA Star軟件拼接,通過NCBI的BLAST比對(duì)分析,選取同源性較高的、年份較近的、地域不同的參考株序列,、用 Mega7.0軟件采用 Neighbour joining的bootstrap重復(fù)計(jì)算500次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果 2011—2016年珠海市的56起急性NV胃腸炎聚集性及暴發(fā)疫情的病例,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè),都是GⅡ群,未檢出GⅠ群,總計(jì)576份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果見表2。每起疫情選取3～4份NV核酸陽性標(biāo)本,共計(jì)203份標(biāo)本全部為NoV GⅡ型。

2.2 序列比對(duì)與進(jìn)化分析 樣品株按照疫情暴發(fā)時(shí)間由先到后編號(hào),年份后以英文字母順序排列,測(cè)序得到的NV核苷酸序列剔除兩端的引物序列后,進(jìn)行核苷酸序列編輯、經(jīng)BLAST搜索比對(duì)及多序列同源性比對(duì)分析；用N/J法繪制遺傳進(jìn)化樹后發(fā)現(xiàn)56株均為GⅡ群,可分為8個(gè)基因亞型,其中GⅡ.4亞型有4株與GⅡ.4 2006 b分到同一簇,另外4株與GⅡ.4/Sydney分到同一簇,14株與GⅡ.3型參考株分到同一簇,14株與GⅡ.17型參考株分到同一簇,5株與GⅡ.6型參考株分到同一簇,2株與GⅡ.7型參考株分到同一簇,1株與GⅡ.5型參考株分到同一簇,12株與GⅡ.p16-GⅡ.2參考株分到同一簇。遺傳進(jìn)化樹見圖1。

表2 2011—2016年胃腸炎疫情諾如病毒核酸檢測(cè)數(shù)據(jù)Tab.2 Detection results of norovirus gastroenteritis outbreaks in Zhuhai during 2011-2016

按照檢測(cè)樣本的采集年分析,如表3所示,2011年6月的為GⅡ.4 2006b；2011年11月2起都是GⅡ.7；2012年上半年3起是GⅡ.4 2006b,1次GⅡ.5；從2012年10月開始到2013年初都是GⅡ.4/Sydney 2012,2013年底到2014年初5起是GⅡ.6,4次是GⅡ.3；2014年11月開始到2015年初12起都是GⅡ.17；2015年9月份開始到2016年初7起都是GⅡ.3；2016年6月份2起是GⅡ.17,9月3次是GⅡ.3；2016年11月份～12月份12起全部是GⅡ.p16-GⅡ.2。2011—2016年NV不同型別在各年份的分布見表3。

3 討論

珠海地區(qū)每年有多起NV引發(fā)的暴發(fā)疫情,僅2011年—2016年有56起,而據(jù)突發(fā)公共衛(wèi)生事件管理信息系統(tǒng)信息(http://10.249.1.170),同期全國(guó)共報(bào)告NV胃腸炎暴發(fā)疫情340起,珠海在全國(guó)占比是16.47%,2016年全國(guó)共報(bào)告134起,而珠海地區(qū)就發(fā)生了18起,占比13.43%,作為一個(gè)地級(jí)市,珠海NV疫情的次數(shù)明顯高于其他地區(qū),一方面可能是因?yàn)镹V暴發(fā)存在一定的區(qū)域性,沿海地區(qū)更適于NV的儲(chǔ)存及傳播,另一方面可能是預(yù)警系統(tǒng)敏感,對(duì)每1起疫情都能及時(shí)響應(yīng),并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)后進(jìn)行精準(zhǔn)處置。2015年—2016年暴發(fā)疫情較多,與全國(guó)形勢(shì)一致。NV胃腸炎疫情高峰時(shí)段主要集中在11月份到次年的3月份,此段時(shí)間被定義為一個(gè)NV流行季［3］。突發(fā)公共衛(wèi)生事件管理信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)顯示,2013年—2016年全國(guó)NV流行季所發(fā)生的NV疫情占全年發(fā)生疫情的80.5%(260/323)。珠海情況亦如此,2011年—2016年期間發(fā)生56起NV疫情,只有12起不在此時(shí)間段,其他均發(fā)生在高峰期,占78.58(44/56)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,從2011年—2016年所有暴發(fā)疫情的病例檢測(cè)均為GⅡ基因型,未發(fā)現(xiàn)其他型別,這與李暉等［4］學(xué)者對(duì)廣東省所做研究結(jié)果一致,自2005年以來,引起廣東省NV胃腸炎的只有諾如病毒 GⅡ群。 而在此期間,江蘇［5］、湖北［6］等地均有 GⅠ群檢出,提示南北地區(qū)差異明顯,廣東省獨(dú)特的地理位置和氣候環(huán)境造成毒株型別分布不同。

序列分析發(fā)現(xiàn),在全世界范圍內(nèi)廣泛流行的GⅡ.4/2006b基因型在2011—2012流行季流行,到2012年底就被替換為變異株GⅡ.4/Sydney—2012,經(jīng)短時(shí)間流行后,GⅡ.4及其變異株于2013年2月至 2016 年底未再出現(xiàn),唐震［5］、李靜［6］等的研究都存在GⅡ.4型,說明GⅡ.4型可能僅在廣東地區(qū)低流行,其他地區(qū)仍有流行。GⅡ.17是2014—2015流行季珠海流行的唯一型別,到2015年9月才有GⅡ.3出現(xiàn),GⅡ.17與GⅡ.3交替出現(xiàn),直到2016年9月,完全被GⅡ.17主導(dǎo),據(jù)報(bào)道GⅡ.17基因型在日本,韓國(guó)、澳大利亞、中國(guó)臺(tái)灣、廣東、江蘇、上海、湖北等地都有發(fā)現(xiàn),并在此段時(shí)間成為優(yōu)勢(shì)株［7-12］。到了2016年底,一個(gè)新的重組株出現(xiàn)并替代了GⅡ.17,并在此時(shí)間段成為唯一型別。11月21日發(fā)生第1次暴發(fā)疫情,接著在下面的一個(gè)月連續(xù)發(fā)生了11次由GⅡ.p16-GⅡ.2引發(fā)的疫情,且暴發(fā)地點(diǎn)均為幼兒園和小學(xué),與其他地區(qū)報(bào)道的此型病毒感染人群一致［13-15］,提示GⅡ.p16-GⅡ.2主要引起兒童感染。同時(shí),在廣東省多地以及德國(guó)、日本、中國(guó)臺(tái)灣等地相繼出現(xiàn)GⅡ.p16-GⅡ.2的報(bào)道［14］,顯示該型NV已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行。

表3 2011—2016年諾如病毒基因型分布表Tab.3 Distribution of genotypes of NV during 2011-2016

圖1 諾如病毒的N/S區(qū)域遺傳進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of N/S regions of NV

GⅡ.p16-GⅡ.2作為新出現(xiàn)的重組株,基因進(jìn)化樹顯示,中國(guó)香港的 KY817739,中國(guó)臺(tái)灣的KY457733、俄羅斯的 KY210921,以及江蘇的MF167652遺傳距離很近。GⅡ.P16/GⅡ.2 NV的出現(xiàn)和傳播的具體機(jī)制尚不明確,諾如病毒ORF1/ORF2重疊交界區(qū)發(fā)生型間或型內(nèi)重組的幾率較大,重組是病毒進(jìn)化的主要機(jī)制之一,通過重組導(dǎo)致病毒毒力、易感性、環(huán)境耐受性等方面的變化,GⅡ.p16目前已報(bào)道的重組株包括:GⅡ.p16/GⅡ.16、GⅡ.p16/GⅡ.17、GⅡ.p16/GⅡ.2、GⅡ.p16/GⅡ.6、GⅡ.p16/GⅡ.4［15］,提示今后監(jiān)測(cè)中應(yīng)加強(qiáng) RdRp和衣殼蛋白檢測(cè),密切關(guān)注該重組NV的流行和進(jìn)化,警惕引起全球性NV暴發(fā)流行的可能。

利益沖突:無