應(yīng)用高通量測序技術(shù)快速鑒定未分型甲型流感病毒

茅海燕 孫逸 樓秀玉 顏浩 程偉 姚文武 王欣瑩 潘軍航 張嚴(yán)峻

高通量測序技術(shù)具有通量大、速度快、精確度高、單堿基成本低等優(yōu)勢［1］。近年來,高通量測序平臺已成功應(yīng)用于新病原檢測與發(fā)現(xiàn)、病毒準(zhǔn)種檢測和病毒全基因組測序研究等方面［2-4］。甲型流感病毒型別眾多,H7N9禽流感疫情之外,部分省份還發(fā)生了H10N8和H5N6亞型禽流感病毒感染人的疫情［5-6］。有了高通量測序技術(shù),我們可以在病例發(fā)生之初,從臨床標(biāo)本中快速獲得病毒全基因序列,準(zhǔn)確快速地鑒定病毒亞型,并對病毒開展溯源和基因片段重配特征等研究。

Ion torrent個人化操作基因組測序儀(Personal Genome Machine,PGM)是基于新一代半導(dǎo)體測序技術(shù)的高通量測序平臺。與其他二代測序儀相比,其操作更簡單、測序成本更低、測序時間更短并具有強(qiáng)大的可擴(kuò)展性［7］。

本實(shí)驗(yàn)室自2013年起利用PGM平臺建立了甲型流感病毒二代測序技術(shù),對外環(huán)境中采集的部分甲型流感病毒陽性而常規(guī)流感分型陰性的標(biāo)本進(jìn)行了二代測序,獲得了病毒序列,進(jìn)一步通過病毒血凝素(hemagglutimin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)基因序列比對,對這些甲型禽流感病毒進(jìn)行了亞型鑒定。

1 材料與方法

1.1 禽流感標(biāo)本來源 用于PGM平臺測序的禽類拭子和外環(huán)境標(biāo)本共9份,標(biāo)本來源、類型和采集時間見表1。

表1 用于PGM平臺測序的禽類拭子和外環(huán)境標(biāo)本信息Tab.1 The imformation of the avian swabs and environmental samples for PGM sequencing

1.2 病毒RNA提取 標(biāo)本RNA用RNeasyMini病毒RNA提取試劑盒(Qiagen,德國)提取,標(biāo)本前處理參照中國疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的《職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案》(2011年版)進(jìn)行,最終取標(biāo)本200 μl按照廠家說明書提取病毒RNA,用50 μl洗脫液進(jìn)行洗脫,提取的RNA-80℃保存或直接用于熒光定量RT-PCR檢測。

1.3 禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測 禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測采用AgPath-IDTM試劑盒進(jìn)行(Applied Biosystems,美國),檢測項目包括甲型流感病毒通用型、H5N1亞型、H7N9亞型和H9N2亞型,引物探針序列由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心提供。反應(yīng)體系25 μl:buffer(2x)12.5 μl,上下游引物(20 μmol/L)各 0.6 μl,探針(20 μmol/L)0.3 μl,Enzyme Mix 1 μl,RNA 5 μl,加水至 25 μl。 反應(yīng)程序:逆轉(zhuǎn)錄 50 ℃,10 min；熱啟動95 ℃,10 min；PCR 循環(huán)94 ℃,15 s；55℃,35 s并采集熒光信號,共40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國)上完成。

1.4 甲型流感病毒全基因組擴(kuò)增 甲型流感病毒基因組核酸擴(kuò)增采用PathAmpFluA試劑盒進(jìn)行(Applied Biosystems,美國)。反應(yīng)體系配置和反應(yīng)程序參照試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物使用Ampure XP磁珠(Beckman,美國)進(jìn)行純化,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增質(zhì)量,同時采用QUBIT 2.0(Thermo Fisher,美國)對純化產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

1.5 二代測序混合文庫制備 取100 ng擴(kuò)增純化后的標(biāo)本核酸,使用Next Fast DNA Fragmentation＆Library Prep Set for Ion Torrent試劑盒(New England Biolabs,美國)進(jìn)行文庫制備。建庫流程包括DNA酶切打斷,片段化產(chǎn)物純化,片段化產(chǎn)物與barcode(Thermo Fisher,美國)連接、連接后產(chǎn)物片段篩選、PCR擴(kuò)增、文庫定量、標(biāo)本文庫稀釋及最終混合文庫制備等步驟。然后分別采用 QUBIT 2.0和Bioanalyzer 2100儀器(Agilent公司,美國)對文庫的濃度及平均長度進(jìn)行檢測。

1.6 測序模板制備及測序 利用Ion PGM IC 200試劑盒在Ion Chef儀器(Applied Biosystems,美國)上完成測序模板的制備及測序芯片(Ion 314、316和318 Chip)上樣,之后在 Ion Torrent PGM測序儀(Applied Biosystems,美國)上進(jìn)行測序反應(yīng),選擇讀長200 bp反應(yīng)程序。

1.7 生物信息學(xué)分析

1.7.1 測序數(shù)據(jù)分析:測序數(shù)據(jù)處理在PGM服務(wù)器中利用Ion Torrent Suite v3.0進(jìn)行,分析過程包括電信號轉(zhuǎn)化、堿基讀取、質(zhì)量控制、比對控制及插件的運(yùn)行等環(huán)節(jié)。在電信號轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)只保留活躍的孔信號數(shù)據(jù)。在SFF文件環(huán)節(jié)進(jìn)行長度、信號活躍度、文庫片段、單克隆ISP確認(rèn)、信號條件情況等篩選后,對符合各項條件的片段數(shù)據(jù)進(jìn)行保留形成最終文庫讀長,以FASTQ形式進(jìn)行下游各個插件的分析。

1.7.2 流感病毒亞型鑒定:采用FluAtyping v4.0和PathogenAnalyzer兩個插件進(jìn)行分析,根據(jù)插件內(nèi)自帶的甲型流感各亞型全基因組序列,對有效讀長進(jìn)行拼接,獲得流感病毒8個片段的全基因組序列,繼而通過HA和NA序列比對完成流感病毒亞型鑒定。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR鑒定結(jié)果 這9份標(biāo)本經(jīng)熒光定量PCR檢測,均為 fluA陽性,但用針對 H5N1、H7N9和H9N2亞型的引物探針檢測均為陰性或僅HA陽性而NA陰性,各標(biāo)本檢測結(jié)果以及陽性結(jié)果的Ct(cycle threshold)值見表2。

表2 9份標(biāo)本fluA、H5N1、H7N9及H9N2熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果Tab.2 The results of real-time RT-PCR of nine samples for fluA、H5N1、H7N9 and H9N2

2.2 文庫構(gòu)建起始模板濃度 甲型流感病毒核酸經(jīng)擴(kuò)增和磁珠純化后,利用QUBIT2.0測定9個純化產(chǎn)物的核酸濃度,分別為 100、94.8、47.2、69.8、84.6、34.3、104、133 和50.2 ng/μl,均能夠滿足后續(xù)文庫構(gòu)建的要求。

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析 利用Ion Torrent Suite v3.0數(shù)據(jù)分析軟件,對9個標(biāo)本測序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析,從總堿基數(shù)、質(zhì)量高于Q20標(biāo)準(zhǔn)的堿基數(shù)、總讀長數(shù)、平均讀長長度、測序深度等方面對測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行綜合評估,具體見表3,為更有助于亞型的判定,對HA和NA測序深度進(jìn)行了進(jìn)一步分析,具體見表4。

表3 9份標(biāo)本測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Tab.3 The sequencing data quality assessment of nine samples

2.4 拼接數(shù)據(jù)比對與病毒型別鑒定 9個標(biāo)本拼接后的序列在數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,共鑒定得到7種亞型(表 4),其中 H2N3、H5N6、H5N8、H7N1、H7N7、H11N3亞型流感病毒陽性標(biāo)本各1個,H6N6亞型流感病毒陽性標(biāo)本3個,未發(fā)現(xiàn)混雜亞型標(biāo)本。

3 討論

根據(jù)流感病毒表面HA和NA可以將甲型流感病毒劃分為18個HA亞型和11個NA亞型［8-9］。目前在人群中流行的甲型流感病毒主要是H1N1和H3N2亞型,能夠突破種間屏障傳播給人的禽流感病毒主要包括H5N1、H9N2和 H7N9等,但也有一些其他少見的新甲型禽流感病例被不斷發(fā)現(xiàn)和報告,如 H10N8、H5N6 和 H6N1 等［5-6,10］。 對禽流病毒開展監(jiān)測,及時分析病毒的變異情況和流行趨勢,對于流感大流行的預(yù)測和預(yù)警具有重要意義［11-12］。然而流感病毒變異和重配速率較快,新亞型層出不窮,第二代測序技術(shù)能夠直接對標(biāo)本中的病原體進(jìn)行快速鑒定,獲得新病原的全基因組序列,特別適用于新病原或未知病原體的快速鑒定。

本研究通過對標(biāo)本處理和建庫流程的優(yōu)化,利用PGM二代測序平臺對禽流感監(jiān)測項目中采集的9份甲型流感病毒陽性而H5N1、H7N9和H9N2亞型陰性的外環(huán)境標(biāo)本進(jìn)行了序列測定。共鑒定出7種流感病毒亞型,提示浙江省外環(huán)境中存在著多種禽流感病毒亞型的共同流行,其中H5N6和H7N7亞型經(jīng)文獻(xiàn)報道均有感染人的疫情發(fā)生,因此在不明原因肺炎病例、外環(huán)境和禽類中開展新型流感病毒的持續(xù)監(jiān)測和病原基因分析,對公共衛(wèi)生具有重要意義［6,11］。此9份標(biāo)本經(jīng)二代測序亞型鑒定未發(fā)現(xiàn)混合標(biāo)本,但是由于禽流感外環(huán)境標(biāo)本來源復(fù)雜,存在多種亞型混合情況［11］。二代測序不需要亞型特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,適合對混合標(biāo)本進(jìn)行分析,今后的實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步加深此方面的研究。

在測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估中發(fā)現(xiàn)3、6及7標(biāo)本的測序深度較其他標(biāo)本低,結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程及上機(jī)分析結(jié)果,本研究認(rèn)為有兩個可能的原因:(1)該亞型實(shí)際存在的病毒載量偏低,如3號標(biāo)本熒光定量PCR檢測Ct值已經(jīng)大于30；另外雖然都經(jīng)過了PathAmpFluA試劑盒的全基因組擴(kuò)增,但不同亞型流感病毒的擴(kuò)增效率可能存在差異,相較于常規(guī)存在于外環(huán)境標(biāo)本中占據(jù)優(yōu)勢的亞型(如H7N9及H9N2),6、7號標(biāo)本中存在的流感亞型可能不具有擴(kuò)增優(yōu)勢,導(dǎo)致這些非常規(guī)亞型測序深度較低；(2)由于這些標(biāo)本均與其他標(biāo)本或毒株個體共享一張芯片,病毒載量高的常見亞型(H7N9及H9N2)可能在實(shí)驗(yàn)及分析過程中占有大部分測序深度資源,從而導(dǎo)致部分標(biāo)本深度較低。目前PGM二代測序平臺仍存在操作步驟和影響因素較多、對操作人員要求高等不足之處,需要進(jìn)一步針對不同的標(biāo)本類型和病原類別深入進(jìn)行測序方法的摸索和優(yōu)化,以便建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序。

本研究實(shí)現(xiàn)了在收到標(biāo)本后3天左右,通過建庫、測序及數(shù)據(jù)處理流程,即可獲得流感病毒序列和亞型鑒定結(jié)果,為應(yīng)對新型流感病毒突發(fā)疫情提供了技術(shù)儲備。利用流感病毒的全基因組序列可進(jìn)一步開展病毒基因溯源、重配和進(jìn)化分析,為流感病毒病原學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持。

利益沖突:無