云南省雙柏縣一犬傷多人事件調(diào)查及狂犬病病毒進化分析

郭興祥 楊衛(wèi)紅 馮云 章域震 周芬 李映金 張海林

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的急性致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,人主要通過患狂犬病動物咬傷而感染發(fā)病,病死率幾乎為100%［1］。我國本輪狂犬病流行始于本世紀初,近10多年來,狂犬病發(fā)病數(shù)呈逐年下降趨勢,從2007年3 303例下降至2017年512例［2］。云南省狂犬病流行趨勢與全國狂犬病流行相似,近幾年疫情亦呈明顯下降趨勢。楚雄彝族自治州(楚雄州)位于云南省中部地區(qū),轄10個縣(市),近幾年犬間狂犬病疫情較為嚴重,一犬傷多人事件常有發(fā)生,幾乎每年都有人間狂犬病臨床診斷病例報告［3-4］。本研究于2011—2017年在楚雄州雙柏縣開展一犬傷多人事件監(jiān)測及流行病學調(diào)查,同時采集肇事犬和狂犬病死亡患者腦組織標本進行RV抗原檢測及核蛋白(Nucleoprotein,N)基因序列測定與分析,結果如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 狂犬病病例資料來源于雙柏縣和楚雄州網(wǎng)絡審核報告病例及其個案調(diào)查表。一犬傷多人事件流行病學調(diào)查資料來源于雙柏縣疾病預防控制中心(CDC)。

1.2 標本采集 2011—2017年雙柏縣CDC采集一犬傷多人事件狂犬腦組織標本7份,狂犬病病例尸檢腦組織標本1份(此為一犬傷3人事件而導致死亡的狂犬病患者,經(jīng)家屬同意,由雙柏縣公安局和雙柏縣疾病預防控制中心專業(yè)技術人員負責采集,采集時間為患者死亡后11 h)。標本置于2 ml螺旋蓋凍存管,用冷藏箱運輸?shù)皆颇鲜〉胤讲》乐嗡《緦嶒炇覚z測,-80℃冰箱保存。

1.3 RV抗原檢測 采用直接免疫熒光試驗,用熒光標記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(Chemicon,Temecula,CA,USA)對犬和人腦組織標本進行RV抗原檢測,按文獻方法操作［1,7］,熒光顯微鏡觀察結果。

1.4 RV核酸檢測和N基因序列測定 采用RTPCR法。用 TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)試劑提取病毒 RNA。用 Ready-To-Go You-Prime First-strand Beads(GE Healthcare,USA)反轉錄合成cDNA。巢式PCR法擴增RV N基因片段,引物及操作方法見文獻［1,7］。選擇RV核酸陽性樣本,使用 50 μl反應體系,用 Go Taq Green Master Mix(Promega,USA)擴增N基因全序列。引物及操作方法見文獻［7,9］。擴增產(chǎn)物在生工生物工程上海有限公司完成測序。

1.5 序列分析 用DNAStar軟件的SeqMan對所獲核苷酸序列進行編輯,MegAlign進行序列同源性分析；用 MEGA 5.0軟件鄰接法(Neighbor-Joining method)構建系統(tǒng)進化樹。除使用本次從雙柏縣獲得的RV N基因序列外,引用GenBank中27株RV N基因序列,其中近期相鄰縣9株(楚雄州楚雄市1株和祿豐縣2株、大理州祥云縣1株、普洱市景東縣2株及景谷縣和鎮(zhèn)源縣各1株、紅河州金平縣1株)；2006—2007年楚雄州(牟定縣)、曲靖和昭通市各1株；其他省份8株(四川2株、廣西2株、貴州1株、湖南1株、湖北1株和重慶1株)；東南亞國家7株(緬甸1株、老撾1株、泰國1株、越南1株、柬埔寨1株、印度尼西亞1株和印度1株)。

2 結果

2.1 楚雄州狂犬病流行概況 楚雄州轄10縣市,1964—2016年全州共報告狂犬病病例23例,其中1981年6例、2006年5例、2011年2例、2012年2例、2014年5例、2015年1例、2016年2例。其中楚雄市5例、牟定縣6例、大姚縣3例、永仁縣4例、祿豐縣2例、雙柏縣3例(1981年2例和2014年1例)。

2.2 一犬傷多人事件調(diào)查 2011—2017年雙柏縣共發(fā)生12起一犬傷多人事件,犬傷暴露35人,其中妥甸鎮(zhèn)4起、法脿鎮(zhèn)5起和大麥地鎮(zhèn)3起(表1)。除2011年和2017年外,該縣每年均有一犬傷多人事件發(fā)生,不僅縣城(妥甸鎮(zhèn))發(fā)生犬間狂犬病疫情,邊遠山區(qū)(法脿鎮(zhèn)和大麥地鎮(zhèn))也有犬間疫情。其中11起一犬傷多人事件(S1—S11)的32例犬傷暴露人員(均為Ⅲ級暴露)均進行傷口處理和狂犬病疫苗全程接種,至今未發(fā)??；另一起為2014年5月法脿鎮(zhèn)發(fā)生的一犬傷3人事件(S12),3例犬傷人員均未規(guī)范處置,導致1人狂犬病發(fā)病死亡(暴露者1,矣某蘭,女,45歲)、2人(暴露者2,矣某琴,女,50歲和暴露者3,黎某某,女,39歲)至今未發(fā)病。本次肇事犬為死亡患者家的自養(yǎng)犬(2011年12月收養(yǎng)犬,已養(yǎng)2年6個月),該犬未接種過狂犬病疫苗,咬傷第三人后被撲殺。該一犬傷3人事件發(fā)生時未上報疾控機構,暴露者1狂犬病死亡后,暴露者2/3全程接種狂犬病疫苗,雙柏縣CDC開展了回顧性調(diào)查。

表1 2012—2016年云南省雙柏縣一犬傷多人事件背景信息Tab.1 Background information of the dog-biting events from Shuangbai county of Yunnan province in 2012—2016

2.3 RV抗原檢測和序列測定 送檢的7份一犬傷多人肇事犬腦組織和1份人腦組織(為前述暴露者1矣某蘭的標本)均為RV抗原和核酸陽性。其中,從2012—2015年的5份犬腦標本(CYN1497D、CYN1271D、CYN14127D、CYN14130D、CYN15132D)和1份人腦標本(CYN14107H)中獲得N基因全序列(GenBank接受號為 KP202430、KP202440、KP072018、KT932681、KT932684 和 KT932686)。2015年和2016年各有1份犬腦陽性標本未做N基因序列測定。

圖1 云南省雙柏縣6株狂犬病病毒核蛋白基因序列系統(tǒng)進化樹Note:▲The rabies virus strains in Shuangbai county from 2012 to 2015Fig.1 Phylogenetic analysis on the nucleoprotein gene sequences of 6 rabies virus strains in Shuangbai county of Yunnan province

2.4 進化分析 本次雙柏縣6株RV的N基因序列與27株RV參考株相應序列構建系統(tǒng)進化樹,圖1顯示,雙柏縣RV與此前鑒定的China-I(又稱YNA)進化群病毒株［6-7］同在一個大分支,均屬China-I進化群。但雙柏株間也存在一定差異,并可分為兩個進化亞支,其中來自暴露者1(矣某蘭)即狂犬病病人的病毒株(CYN14107H)與同期犬病毒株(CYN1497D)親緣關系最近,并與相鄰楚雄州祿豐縣(CYN1499D)和普洱市景東縣(CYN1373D)流行株具有較近的進化關系；另4株則與相鄰大理州祥云縣(CYN13115H)、楚雄市(CYN1381D)和四川省(SCR1016P)流行株進化關系最近。進化分析還發(fā)現(xiàn),雙柏株與2006年和2007年云南省昭通市(Yunnan Zt07)、曲靖市(Yunnan Qj07)和楚雄州牟定縣(Yunnan Md06)流行株進化關系較遠,并與我國廣西(GXSL和GXN119)、貴州(Guizhou A101)、重慶(CQ92)等省區(qū)以及緬甸(9909BIR)、老撾(02001LAO)、泰國(D9/52)、越南(01016VNM)和柬埔寨(9908CBG)等東南亞流行株存在明顯差異(圖1)。

2.5 同源性分析 本次雙柏縣6株與省內(nèi)相鄰地區(qū)(12株)和四川省(2株)RV流行株N基因序列進行同源性分析,表2顯示,雙柏縣6株RV的核苷酸和氨基酸同源性均在99.6% ～100%之間,它們與相鄰楚雄州楚雄市(CYN1381D)和祿豐縣(CYN1267D)、大理州祥云縣(CYN13115H)和四川省(SCR1016P和SCR0967)流行株的核苷酸和氨基酸同源性亦為99.6% ～100%,但與2006年云南省楚雄州牟定縣(Yunnan Md06)、2007年昭通市(Yunnan Zt07)和曲靖市(Yunnan Qj07)流行株核苷酸和氨基酸同源性分別為97.1%～99.3%和99.1% ～99.6%。

3 討論

由于犬類仍然是當前我國人類狂犬病的主要傳染源,控制犬間狂犬病疫情對消除人間狂犬病具有十分重要的意義［5］。楚雄州疾病預防控制中心于2011年開始在楚雄州建立一犬傷多人事件監(jiān)測系統(tǒng),對及時發(fā)現(xiàn)犬間疫情和防控人狂犬病起到重要作用［6］。本次雙柏縣調(diào)查結果表明,2011—2017年該縣共發(fā)生12起一犬傷多人事件,但僅發(fā)生1例人狂犬病,一犬傷多人事件監(jiān)測在預防人狂犬病中發(fā)揮了極為重要的作用。前述該縣一犬傷3人事件由于漏報而導致1例人狂犬病發(fā)病死亡,此與犬傷暴露者對狂犬病危害性認識不足,暴露后未到醫(yī)療衛(wèi)生機構就診有關。因此,加強偏遠地區(qū)一犬傷多人事件及其他犬傷事件的監(jiān)測,進一步開展狂犬病防治知識宣傳教育,全面提高人民群眾的自我防護意識仍然是當前面臨的重要任務。

暴露后預防處置對預防人狂犬病至關重要［7］。本次雙柏縣漏報的一犬傷3人事件的3名暴露人員均未接受規(guī)范的暴露后預防處置,導致暴露者1(矣某蘭)發(fā)病死亡。結合臨床表現(xiàn)并從該患者腦組織中檢測到RV,根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《WS 281-2008-狂犬病診斷標準》,該病例為狂犬病實驗室診斷病例,亦為云南省本輪狂犬病流行中(2000年以來)雙柏縣唯一1例人狂犬病。暴露者1狂犬病發(fā)病死亡后,通過對暴露者2(矣某琴)和暴露者3(黎某某)的全程補種狂犬病疫苗,對預防發(fā)病無疑是有效的。

表2 云南省雙柏縣6株狂犬病病毒核蛋白基因核苷酸和氨基酸同源性比較Tab.2 Homology analysis of nucleotide and amino acid of nucleoprotein gene fragment of 6 RV strains in Shuangbai county of Yunnan province

目前,中國RV可分為6個進化群(China-I、Ⅱ、Ⅲ、IV、V和 VI),其中 China-I是近幾年優(yōu)勢流行株,主要流行于中國南方,近幾年也有向北方擴散的趨勢［8-9］。 以往證實,云南省有 YN-A、YN-B、YN-C和YN-D共4個進化群流行,并依次屬于China-I、China-VI、China-Ⅱ和 China-Ⅲ［4］。 然而,近幾年云南流行的RV種群發(fā)生了明顯變化,China-I成為主要進化群,未再發(fā)現(xiàn)其他進化群的流行［4,10］。楚雄州位于滇中地區(qū)并與四川省相鄰,此前該州僅發(fā)現(xiàn)China-I(YN-A)［3］。本次進化分析和同源性分析表明,無論是來自雙柏縣患者或犬類還是楚雄州其它地區(qū)(楚雄市和祿豐縣)犬類的RV間均具較近親緣關系,同時還表明該州RV種群分布較為單一,均為China-I,并與相鄰州、市、縣及四川省的China-I流行株高度同源,提示該地區(qū)狂犬病傳播來源很可能是四川省。序列分析還發(fā)現(xiàn),近幾年雙柏縣及其相鄰地區(qū)RV流行株與2006—2007年楚雄州、昭通市和曲靖市RV China-I流行株存在明顯差異,且2006—2007年云南流行株與2005年湖南和湖北省流行株親緣性較高,提示云南本輪狂犬病流行前期和近期的RV China-I流行株的傳播來源不同,但它們都來自與云南相鄰的省份,且前期流行株已被當前流行株替換為主要或唯一流行株。

利益沖突:無