脂肪干細胞對糖尿病大鼠勃起功能障礙的影響

王文華，葛永超，侯全亮，張程達，葛夢潁，田惠子，任炳楠，岳利敏，杜冰會，李丹康，趙青林，OPOLOT Godfrey，張衛(wèi)東

1)鄭州大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系 鄭州 450001 2)鄭州第三人民醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450000 3)美國密歇根州皇家橡樹博蒙特衛(wèi)生系統(tǒng)內科 底特律 48073

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是一種常見的男性性功能障礙性疾病[1]。據預測，2025年全球將有3億2 200萬男人患ED[2]。目前，臨床上常用的治療藥物是5型磷酸酯酶抑制劑(phosphodiesterase 5 inhibitors，PDE5Is)[3],但是它可引起血壓下降、消化不良、頭痛等不良反應[4]。其他的傳統(tǒng)治療方法,如真空負壓吸引裝置、海綿體內藥物注射、陰莖假體植入等因耐受性不良等得不到推廣使用。干細胞療法作為一種可能提高勃起功能的新方法,是目前醫(yī)學領域研究的熱點。這種類型的干細胞包括肌源性干細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)等[5]。其中ADSCs是多能干細胞，具有創(chuàng)傷微小、取材容易等優(yōu)點[6]。它可以分泌神經營養(yǎng)因子，促進神經再生[7]，可以誘導促血管生成因子分泌和受體的表達[8]，可分化成脂肪細胞、軟骨細胞、肌源性和成骨細胞等且具有免疫抑制性[9-10]。本文建立糖尿病大鼠模型,通過海綿體移植ADSCs懸液,觀察其對ED的治療效果，探討可能的生物學機制，為臨床研究與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組108只8周齡SPF級雄性SD大鼠，購自河南省實驗動物中心[許可證號：SCXK(豫)2015-0004]。其中未作任何處理的20只大鼠為正常組。余88只大鼠腹腔注射55 mg/kg鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液構建糖尿病模型。8周后，對隨機血糖超過16.7 mmol/L的大鼠行阿撲嗎啡(apomorphine，APO)實驗[11]。將APO實驗未觀察到勃起的大鼠分為ED模型組和ADSCs治療組。ED模型組海綿體移植PBS緩沖液，而ADSCs治療組海綿體移植ADSCs懸液。

1.2ADSCs分離、培養(yǎng)ADSCs取自大鼠雙側腹股溝脂肪，并按照標準化方法[12]進行分離和培養(yǎng)。選用4周齡、體重60～80 g SPF級SD大鼠2只，無菌條件下取雙側腹股溝處脂肪，剪成糊狀，加入相同體積的1 g/LⅠ型膠原酶溶液37 ℃消化40 min。經過3次低速離心后，按照105個/瓶的密度接種于25 cm2普通細胞培養(yǎng)瓶中，用含體積分數10%胎牛血清和青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞傳代按文獻標準化方法[13]進行。

1.3ADSCs增殖能力檢測和成骨、成脂誘導使用MTT法檢測ADSCs增殖能力，繪制生長曲線，計算3代ADSCs的倍增時間。取3代ADSCs進行成脂誘導、鑒定和成骨誘導、鑒定[14-15]。

1.4大鼠陰莖海綿體移植ADSCs取3代ADSCs，溶于PBS溶液，制成單細胞懸液。大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后以仰臥位固定并消毒會陰部，剪開陰莖包皮后游離陰莖海綿體，橡皮筋結扎陰莖根部，把100 μL的細胞懸液通過1 mL注射器注射至海綿體，2 min后松開橡皮筋，消毒、縫合切口。

1.5大鼠陰莖海綿體內壓(ICP)及平均動脈壓(MAP)測定治療4周后，無菌條件下仰臥位固定麻醉后的大鼠，剪開腹部皮膚，定位海綿體神經和骨盆神經節(jié)。在大鼠的陰莖腳中插入肝素鈉溶液(250 U/mL)的21-G針。與此同時，大鼠右側頸總動脈的近心端和遠心端分別用血管夾和細繩結扎。在頸總動脈的兩個結扎處，顯微鏡剪將血管沿心臟方向剪開，將充滿肝素鈉溶液(250 U/mL)的大鼠頸動脈插管插入頸動脈。21-G針和插管都是通過PE管和三通管與壓力換能器連接。壓力換能器連接到MD 3000信號采集和處理系統(tǒng)。以復刺激參數為電壓10 V，波寬0.2 ms，頻率20 Hz的雙鉤狀電極刺激大鼠海綿狀神經，時間維持1 min，同時把血管夾松開，觀察并記錄ICP和MAP，計算ICP/MAP比值。

1.6免疫熒光染色檢測vWF、α-SMA、nNOS蛋白的表達測量ICP和MAP后，取大鼠陰莖中段組織放入40 g/L的多聚甲醛固定18～24 h，5 μm厚度切片，脫蠟和抗原修復后行一抗孵育，一抗分別為山羊抗兔vWF(1∶500稀釋后使用)、山羊抗小鼠 α-SMA(1∶500稀釋后使用)、山羊抗兔nNOS(1∶200稀釋后使用)，4 ℃過夜，切片清洗后加入二抗孵育，用DAPI復染細胞核3次，每次5 min。選用倒置熒光顯微鏡的視野觀察組織切片，選取200倍的視野采集圖像并進行拍照。選用Image Pro plus 6.0軟件分析熒光圖片。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS 21.0分析。各組大鼠ICP/MAP以及陰莖海綿體vWF、 α-SMA、nNOS蛋白的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1動物模型基本情況最終有58只大鼠納入分析，其中正常組有19只，ED模型組有19只，ADSCs治療組有20只。

2.2ADSCs的鑒定用油紅O染色成脂誘導后的ADSCs，可見脂滴呈鮮紅色。成骨誘導后的ADSCs中，有大量鈣化結節(jié)存在。

2.3各組大鼠陰莖海綿體ICP/MAP比較正常組、ED模型組、ADSCs治療組大鼠ICP/MAP分別為(0.690±0.096)、(0.250±0.096)和(0.440±0.130)，差異有統(tǒng)計學意義(F=78.910，P<0.001)。ADSCs治療組小于正常組，大于ED模型組。

2.4各組大鼠陰莖海綿體vWF、α-SMA和nNOS蛋白的表達結果見圖1和表1。

A、B、C:分別為正常組、ED模型組和ADSCs治療組圖1 各組大鼠陰莖海綿體α-SMA(1)、nNOS(2)和vWF(3)蛋白的表達(免疫熒光染色，×200)表1 各組大鼠nNOS、α-SMA和vWF蛋白表達情況

組別nvWFnNOSα-SMA正常組190.25±0.030.33±0.080.06±0.02ED模型組19 0.04±0.06*0.08±0.07*0.02±0.02*ADSCs治療組200.18±0.11*#0.25±0.08*#0.05±0.04*#F11.72214.8333.943P0.0020.0010.048

*:與正常組相比，P<0.05；#:與ED模型組相比，P<0.05

3 討論

有研究[11-20]表明，ADSCs可以通過改善陰莖血管內皮的功能、修復海綿體平滑肌細胞和內皮細胞等途徑改善大鼠勃起功能。同時，Fandel等[21]指出ADSCs通過從海綿體轉移到受損海綿體的神經，進而促進神經修復。以上結果提示ADSCs在治療ED方面有很多優(yōu)勢。

作者采用了ICP/MAP來評價實驗結果。臧光輝等[19]的研究結果表明，刺激時的電壓水平會影響大鼠的ICP，并且隨著電壓的增大，大鼠ICP也增大。作者也發(fā)現，ICP的值會隨著血壓變化而變化，所以評價大鼠勃起功能時采用了大鼠ICP/MAP這個指標。

陰莖勃起與陰莖海綿體的神經、海綿體的內皮和海綿體的平滑肌等都有關[22]， vWF是海綿體內皮標志物，α-SMA是陰莖海綿體平滑肌標志物，nNOS可以反映出海綿體神經情況，也可以反映出和NO分泌相關神經纖維的情況。作者的研究結果發(fā)現，ADSCs可以增加大鼠陰莖海綿體vWF、α-SMA和nNOS蛋白的表達，提示移植入海綿體的ADSCs分化成了內皮、平滑肌和神經纖維等，促進了大鼠勃起功能的復蘇。

作者發(fā)現如果移植過多的液體，大鼠陰莖海綿體會出現嚴重的水腫。為了達到減輕水腫的目的，把細胞溶解在了100 μL PBS溶液中，這也是本研究優(yōu)于其他方案的地方。

總之，ADSCs可以提高糖尿病大鼠的勃起功能，并可以提高大鼠陰莖海綿體vWF、α-SMA和nNOS蛋白的表達。