外源性胰島素對斑馬魚血糖及其轉(zhuǎn)運的影響

魯程瑤, 張 震, 丁倩雯, 李 解, 劉 宇, 冉 超, 張洪玲, 張進雄, 周志剛

中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術重點實驗室, 北京 100081

糖類參與構成魚體細胞結構，為魚類正常生命活動提供能量，也是合成體脂和非必需氨基酸的重要原料。攝入的糖類在消化道內(nèi)經(jīng)淀粉酶、麥芽糖酶水解為單糖被吸收；吸收后的單糖在肝臟及其他組織進一步氧化分解釋放能量，或用于合成糖原、脂肪、氨基酸，或參與合成其他生理活性物質(zhì)。葡萄糖氧化分解是多數(shù)哺乳動物能量來源的主要途徑，血糖(葡萄糖)是糖類在體內(nèi)的主要運輸形式，糖原是糖類在體內(nèi)的儲存形式。但大量研究表明，魚類主要以蛋白質(zhì)和脂質(zhì)作為能源物質(zhì)，與哺乳動物相比，魚類對糖類的利用能力低下，被認為是先天性的糖尿病患者[1]。當餌料中糖類含量超過一定限度時，魚類會出現(xiàn)抗病力降低、生長遲緩、死亡率提高、脂肪肝等現(xiàn)象[2～5]。

胰島素是唯一降血糖的激素，被認為是調(diào)節(jié)和維持哺乳動物血糖平衡最為重要的調(diào)節(jié)因子[6,7]。但是在魚類糖代謝研究中，胰島素分泌不足被認為是導致魚類糖耐受能力低下的主要原因[1,8,9]。此外，胰島素可促進組織攝取血液中的葡萄糖，從而維持血糖的穩(wěn)定，其中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(glucose transporters，GLUTs)發(fā)揮著重要作用，即葡萄糖通過細胞膜上的GLUTs經(jīng)易化擴散作用進入細胞，因此，魚類葡萄糖轉(zhuǎn)運遲緩也被歸為導致魚類糖利用能力低下的原因之一。

斑馬魚(Daniorerio)屬于輻鰭亞綱、鯉科、短擔尼魚屬的一種硬骨魚。斑馬魚個體小、后代數(shù)量多、養(yǎng)殖周期短，便于實驗室養(yǎng)殖[10]，且其全基因組測序已完成[11]，轉(zhuǎn)基因及敲除斑馬魚系也已建立[12,13]，因此，斑馬魚是進行營養(yǎng)基因組學和營養(yǎng)免疫分析的理想模式生物[14]。其也可用于生長、營養(yǎng)、免疫、毒理等研究領域[15～18]，可節(jié)約時間成本和經(jīng)濟成本。

本研究旨在確定斑馬魚是否存在糖利用障礙并探究其原因，以及進一步探討外源性胰島素對斑馬魚維持血糖穩(wěn)定的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用斑馬魚購自北京中蔬大森林花卉市場，3月齡左右的健康活潑、規(guī)格一致的斑馬魚暫養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點開發(fā)實驗室的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)，每天接近飽食投喂飼喂2次(8:30和16:30)，暫養(yǎng)7 d后開始試驗，養(yǎng)殖全程水溫控制在28.0～30.0℃，pH 6.8～7.5，光照周期為12 h/12 h，每周更換30%的養(yǎng)殖水。

1.2 斑馬魚血漿采集及測定

采用斷尾法采血。將斑馬魚置于冰水浴中麻醉，吸盡魚體表面水分，用無菌手術剪剪斷魚尾后，置于肝素鈉抗凝管中，高速冷凍離心機4℃、2 000 r/min離心2 min后吸取血漿，每3～5尾魚血樣混合。

1.3 葡萄糖耐受試驗及胰島素含量測定

斑馬魚最后一次飼喂結束后，饑餓72 h，隨后冰水浴麻醉，吸盡魚體表面水分，稱重后按每0.1 g體重注射1 μL溶液的比例腹腔注射濃度為0.1 g/mL的葡萄糖溶液。在腹腔注射后的0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h采血漿并分別根據(jù)南京建成生物工程研究所葡萄糖測定試劑盒和上海酶聯(lián)生物技術有限公司胰島素試劑盒的操作說明檢測血糖及胰島素含量。處理組中雌、雄比例為1∶1，各20尾；對照組(僅腹腔注射滅菌去離子水)中雌、雄比例為1∶1，各10尾魚。

1.4 胰島素梯度試驗

Polakof等[19]統(tǒng)計，魚類胰島素腹腔注射劑量一般為1～100 IU/kg，哺乳動物的用量一般為1～2 IU/kg，以此為依據(jù)，將胰島素加入到0.1 g/mL葡萄糖溶液中，制成低(1.25 IU/kg)、中(12.5 IU/kg)、高(125 IU/kg)3個濃度的胰島素和葡萄糖共注射溶液。斑馬魚最后一次飼喂后，饑餓72 h，隨后冰水浴麻醉，吸盡魚體表面水分，稱重后按每0.1 g體重腹腔注射1 μL溶液的比例注射。在腹腔注射后的0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h采血漿檢測血漿胰島素含量。處理組中雌、雄比例為1∶1，各20尾；對照組中雌、雄比例為1∶1，各10尾魚。

1.5 斑馬魚肝胰臟總RNA提取

斑馬魚最后一次飼喂后，饑餓24 h，隨后置于冰水浴麻醉并無菌剖取肝胰臟，將肝胰臟置于加有1 mL Trizol試劑的1.5 mL EP管中并進行勻漿，再向勻漿液中加入200 μL三氯甲烷后劇烈震蕩，靜置5 min后于4℃、12 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，置于-20℃過夜進行核酸沉淀。隨后，4℃、 12 000 r/min離心10 min得到沉淀，于超凈臺內(nèi)吹干后加入30～50 μL DEPC水。測定RNA濃度后，按照1 μg的量進行反轉(zhuǎn)錄，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司。

1.6 實時熒光定量PCR檢測目的基因表達

實時熒光定量PCR使用Tiangen SYBR Green染料，體系為10 μL：5 μL SuperReal Pre-Mix Plus、正反向引物各0.5 μL、cDNA模板2 μL，加RNase-Free ddH2O至10 μL。采用兩步擴增法：95℃預變性10 min；95℃變性5 s，55～60℃退火30 s，共40個循環(huán)。反應結束后統(tǒng)計Ct值，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)后繪圖，并以核糖體蛋白S11(rps11)表達水平作為參照。每個基因表達量的檢測設置6個生物學重復。引物序列見表1。

表1 斑馬魚引物序列Table 1 Primer sequences for zebrafish.

注：insa：胰島素a；insb：胰島素b；glut3：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3；glut10：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白10；glut12：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白12；glut13.1：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白13.1；glut13.2：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白13.2。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因子方差分析，結果以平均值±標準誤(mean±SE)表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 糖負荷對斑馬魚高血糖的影響

為了探究糖負荷狀態(tài)下斑馬魚的血糖變化以及性別間是否存在差異，分別對雌、雄斑馬魚開展葡萄糖耐受試驗。結果顯示(圖1)，雖然腹腔注射對魚造成應激，引起血糖升高，但與對照組相比，無論雌、雄，斑馬魚腹腔注射葡萄糖后血糖水平均顯著升高(P<0.001)，需1 h才到達峰值，隨后逐漸降低[2 h時顯著降低(P<0.001)]，直至6 h才恢復到正常水平。并且，各個時間點雌、雄斑馬魚血糖水平?jīng)]有顯著性差異。外源葡萄糖注射造成了斑馬魚的持續(xù)高血糖，表明斑馬魚存在糖利用障礙。

圖1 性別對斑馬魚血糖的影響Fig.1 Effect of gender on blood glucose of zebrafish.

2.2 斑馬魚持續(xù)高血糖的原因分析

為探究造成斑馬魚持續(xù)高血糖的原因，對斑馬魚血漿胰島素水平以及胰島素基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達情況進行了分析。由2.1可知，斑馬魚在糖負荷狀態(tài)下，血糖在1 h時達到最高，2 h時降低并且能在組與組間分析差異，6 h時恢復到正常水平，因此，后續(xù)試驗中僅對1 h、2 h、6 h的斑馬魚血漿中胰島素含量進行檢測。

在糖負荷狀態(tài)下，與對照組相比，葡萄組斑馬魚血漿胰島素水平并未顯著升高(圖2A)，但斑馬魚胰島素基因insa、insb的表達顯著上調(diào)(圖2B～D)；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達在2 h時才呈現(xiàn)上升趨勢，不存在顯著差異，且滯后于胰島素基因的表達，6 h時表達水平降低，其中glut12、glut13.1差異極顯著(P<0.01)(圖3)。結果提示，斑馬魚持續(xù)高血糖的原因包括胰島素分泌不足和葡萄糖轉(zhuǎn)運遲緩。

2.3 外源性胰島素對斑馬魚血糖的調(diào)節(jié)作用

由圖4可看出，低(1.25 IU/kg)、中(12.5 IU/kg)、高(125 IU/kg)3種濃度的胰島素與葡萄糖溶液共注射進入斑馬魚體內(nèi)后，均表現(xiàn)為0～1.0 h血糖升高，2～6 h逐漸降低恢復至正常水平，說明外源性胰島素具有降低斑馬魚血糖的作用。但是125 IU/kg胰島素濃度組的血糖一直處于較低水平，且變化趨勢不明顯，表明125 IU/kg胰島素注射濃度過高；1.25 IU/kg、12.5 IU/kg濃度胰島素均能使斑馬魚血糖在2 h時恢復到正常水平，且二者沒有顯著差異，故選擇1.25 IU/kg為最適腹腔注射濃度。

2.4 外源性胰島素對胰島素分泌及其基因表達的影響

糖負荷狀態(tài)下，注射最適濃度的胰島素(1.25 IU/kg)，斑馬魚血糖在1 h達到峰值，但胰島素組血糖含量顯著低于葡萄糖組(P<0.05)，并且2 h時血糖已恢復至正常水平，而葡萄糖組3 h時血糖仍處于較高水平(圖5)。進一步對斑馬魚血漿胰島素水平及其基因表達情況進行分析，外源補充胰島素使斑馬魚血漿胰島素水平升高，6 h時仍極顯著高于葡萄糖組(P<0.001)(圖6A)；而胰島素基因表達則被抑制，即1 h時insa的表達極顯著低于葡萄糖組(P<0.001)，2 h時insa、insb的表達均顯著低于葡萄糖組(P<0.05)，且對胰島素基因的抑制直至6 h才得到緩解(圖6B～D)。結果表明外源性胰島素能促進糖負荷狀態(tài)下斑馬魚血糖的恢復，但是對肝胰臟胰島素基因表達具有反饋抑制作用。

圖2 糖負荷狀態(tài)下斑馬魚血漿胰島素含量(A)及其基因表達(B～D)Fig.2 Plasma insulin content(A) and insulin gene expression (B～D) of zebrafish under glucose loading.注：*、**、***分別表示處理組與對照組在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平上差異顯著。

圖3 糖負荷狀態(tài)下斑馬魚葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因表達Fig.3 Expression of glucose transporters genes under glucose loading.注：**表示處理組與對照組相比差異顯著(P<0.01)。

圖4 不同濃度胰島素對雄性斑馬魚(A)和雌性斑馬魚(B)血糖的影響Fig.4 Effects of different concentrations of insulin on blood glucose in male (A) and female (B) zebrafish.

圖5 外源胰島素對斑馬魚血糖的影響Fig.5 Effect of exogenous insulin on zebrafish blood glucose.

2.5 外源性胰島素促進對葡萄糖的轉(zhuǎn)運

前述研究表明，糖負荷狀態(tài)下，葡萄糖轉(zhuǎn)運遲緩是造成斑馬魚持續(xù)高血糖的原因之一。而對于外源性胰島素是否能促進對葡萄糖的轉(zhuǎn)運，需要進一步分析。由圖7可看出，注射胰島素后，1 h時glut3、glut10、glut12、glut13.1和glut13.2基因表達均無顯著差異；2 h時呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，其中glut3、glut12的表達水平均顯著高于葡萄糖組(P<0.05);6 h時，除glut13.1上調(diào)(P>0.05)外，各基因的表達水平與2 h相比下調(diào)，但未達到顯著水平。說明糖負荷狀態(tài)下，外源性胰島素具有促進斑馬魚對葡萄糖的轉(zhuǎn)運的作用。

圖6 糖負荷狀態(tài)下外源胰島素對斑馬魚胰島素含量(A)及其基因表達(B～D)的影響Fig.6 Effect of exogenous insulin on insulin content(A) and gene expression (B～D) under glucose loading.注：*、**、***分別表示處理組與葡萄糖組在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平上差異顯著。

圖7 糖負荷狀態(tài)下外源胰島素對斑馬魚葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達情況Fig.7 Effect of exogenous insulin on expression of zebrafish glucose transporters genes under glucose loading.注：*表示與葡萄糖組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論

糖類是魚體必需的代謝供能底物之一，與魚體的生理功能和生存能力密切相關。哺乳動物的食物中的糖含量一般在50%～60%，雜食性和草食性魚類餌料糖含量一般在30%～40%，肉食性魚類餌料糖含量一般不超過20%[20]。如肉食性的鮭鱒、鱸魚及點籃子魚，當其餌料中糖含量超過25%時，其消化率、飼料利用率和生長率明顯降低[21,22]。正常人在口服一定劑量的葡萄糖溶液后30 min左右血糖達到最高，經(jīng)2.0 h左右回到空腹水平。但從現(xiàn)有的魚類糖耐受試驗結果來看，與人和哺乳動物相比較而言，大多數(shù)魚類在葡萄糖負荷后血糖均升高，并維持較長時間的高血糖現(xiàn)象[19,23](表2)。本研究結果與大多數(shù)魚類研究結果一致，斑馬魚腹腔注射葡萄糖溶液后，6 h才逐漸恢復至正常水平，表現(xiàn)出持續(xù)的高血糖現(xiàn)象。而且，人類、獼猴以及大鼠中，雄性的血糖水平高于雌性[31～37]，但是本研究結果表明雌、雄斑馬魚的血糖變化趨勢一致，說明斑馬魚的血糖不存在性別差異。

表2 魚類糖耐受試驗結果Table 2 Glucose tolerance tests of fish.

胰島素可以促進細胞攝取葡萄糖，促進糖原合成，并抑制糖原降解。對于哺乳動物，血糖升高后方能誘導和促進胰島素分泌。正常人基礎血漿胰島素水平為5～20 mIU/L；口服葡萄糖30 min左右上升至峰值(可為基礎值的5～10倍，多數(shù)為50～100 mIU/L)，然后逐漸降低，3 h后降至基礎水平。但是對于攝取糖類是否可以誘導魚類胰島素分泌尚存爭議[38～45]。本研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚在糖負荷狀態(tài)下，與對照組相比，葡萄糖組胰島素基因表達上調(diào)，但血漿胰島素水平并未出現(xiàn)顯著差異。這與在虹鱒中獲得的結果一致[41]。而且與葡萄糖組相比，注射胰島素組斑馬魚血糖顯著降低，即胰島素組斑馬魚2 h時血糖已恢復至正常水平，而葡萄糖組3 h仍處于高血糖狀態(tài)；說明胰島素分泌不足是引起斑馬魚糖負荷后持續(xù)高血糖的原因之一，而外源補充胰島素能促進斑馬魚血糖的降低。

然而，糖負荷狀態(tài)下，外源補充胰島素會抑制機體自身胰島素的分泌及相關基因的表達。用濃度為150 mg/dL的葡萄糖體外灌注犬的胰腺，當外源性豬胰島素以180～420 μU/mL的濃度加入灌注液時，胰腺分泌的胰島素顯著減少，外源性胰島素反饋抑制自身胰島素的分泌[46]。體內(nèi)研究亦表明，外源性胰島素對機體自身胰島素的分泌及相關基因的表達具有負反饋作用[47～50]。如在注射胰島素的低血糖大鼠中，胰島素原mRNA水平減少58%(P<0.01)；在注射胰島素的高血糖大鼠中，胰島素原mRNA水平減少44%(P<0.01)[51]。本研究與上述研究結果一致，糖負荷狀態(tài)下外源補充胰島素使斑馬魚胰島素基因表達顯著下調(diào)(P<0.05)，說明外源性胰島素對斑馬魚肝胰臟胰島素基因也具有反饋抑制作用。

機體糖穩(wěn)態(tài)是通過維持機體糖異生以及葡萄糖的吸收和儲存之間的平衡得以實現(xiàn)的。由消化道吸收或非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來的葡萄糖經(jīng)血液循環(huán)運送到各組織，供全身利用。由于葡萄糖是一種極性分子，不能經(jīng)自由擴散通過細胞脂質(zhì)雙分子層的疏水結構，除小腸和腎小管可以通過鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(sodium-glucose co-transporters，SGTLs)主動轉(zhuǎn)運吸收葡萄糖外，其他組織細胞都必須經(jīng)細胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUTs)將葡萄糖轉(zhuǎn)運進細胞[52]。過去，大多數(shù)學者將魚類對葡萄糖利用率低下的部分原因歸結為轉(zhuǎn)運載體的缺失[53]。但隨著科學技術的發(fā)展以及分子技術手段的不斷提升，諸多研究表明魚類存在GLUTs并在調(diào)節(jié)葡萄糖的吸收方面發(fā)揮重要作用[39,54,55]。與對照組和胰島素組結果一致，葡萄糖組在腹腔注射葡萄糖后6 h血糖恢復到正常水平，但GLUTs基因表達未顯著上調(diào)，且出現(xiàn)上升趨勢的時間點滯后于血漿胰島素水平及其基因表達，說明葡萄糖轉(zhuǎn)運遲緩也是造成斑馬魚持續(xù)高血糖的原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)在外源性胰島素的作用下，GLUTs的表達增加，說明外源性胰島素能促進斑馬魚血糖轉(zhuǎn)運，但其作用方式及機制有待于進一步探究。鑒于GLUTs在哺乳動物葡萄糖轉(zhuǎn)運中發(fā)揮的重要作用，若能探明魚類GLUTs的種類、表達量、功能及作用機制，將有助于了解魚類的糖代謝機制，為促進魚類對糖類的利用提供有力支持。