不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43、軸突生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A表達(dá)的影響?

孫竹梅 趙雅寧△ 李建民 王國(guó)立 陳長(zhǎng)香 張美航 王 靜

(1 華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 2 唐山市開(kāi)灤總醫(yī)院, 唐山 063000)

缺血性腦血管病作為我國(guó)常見(jiàn)病和高發(fā)病嚴(yán)重威脅人類健康[1-4]。腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷是誘發(fā)神經(jīng)功能缺失的關(guān)鍵所在。尋找減少神經(jīng)元損傷的有效干預(yù)方法,對(duì)腦缺血類疾病的預(yù)防及功能恢復(fù)有深遠(yuǎn)意義。有研究表明[5-6],腦缺血發(fā)生前進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠使腦組織對(duì)后續(xù)發(fā)生的嚴(yán)重?fù)p傷產(chǎn)生耐受能力,對(duì)大腦的神經(jīng)功能有保護(hù)作用。然而,其具體機(jī)制以及運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度等問(wèn)題有待進(jìn)一步闡明。軸突的準(zhǔn)確投射與其形成、生長(zhǎng)對(duì)神經(jīng)再生有重要作用[7]。內(nèi)源性再生相關(guān)因子生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43, GAP-43),是調(diào)節(jié)軸突形成新聯(lián)系和引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的一種快速轉(zhuǎn)運(yùn)胞膜磷酸蛋白[8-9]。而髓鞘相關(guān)蛋白神經(jīng)突起生長(zhǎng)抑制分子中,軸突生長(zhǎng)抑制因子-A(neurite outgrowth inhibitor-A, Nogo-A)對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用[10-11]。本研究通過(guò)建立不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的腦缺血模型,觀察實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)GAP-43、Nogo-A的表達(dá)變化及神經(jīng)細(xì)胞丟失的變化,初步探討兩者在不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)預(yù)處理全腦缺血大鼠神經(jīng)元損傷中的作用,旨在為腦缺血的預(yù)防及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

多克隆GAP-43抗體和多克隆Nogo-A抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);兩步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司);One Step SYBR?PrimeScriptTM PLUS RT-PCR Kit, RNAiso Plus(大連寶生物工程有限公司);引物(上海生工生物工程股份有限公司);ZH-PT型計(jì)算機(jī)控制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);5417R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);旋渦混勻器(江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理

80只3月齡雄性SD大鼠由北京維通利華公司提供(SCXK(京)2003-003),體質(zhì)量230～310g。隨機(jī)平均分成假手術(shù)組、腦缺血再灌注組(I/R組)、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組。分別作如下處理： 假手術(shù)組分離暴露血管,但不電凝椎動(dòng)脈、不夾閉頸總動(dòng)脈;腦缺血再灌注組應(yīng)用改良的Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法[5]制備全腦缺血模型,動(dòng)物術(shù)前12h禁食,常規(guī)水合氯醛麻醉,頸正中切口,分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈,在其下置線備用。隨后將大鼠翻正并用立體定位儀固定頭頸部,枕后部正中切口,暴露雙側(cè)第1頸椎橫凸翼孔,直視下電凝其下通過(guò)的椎動(dòng)脈,每次電凝時(shí)間約為2～4s,使其永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠,待恢復(fù)24h后以無(wú)創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,缺血10min后松開(kāi)動(dòng)脈夾,以實(shí)現(xiàn)再灌注。

參照筆者前期所用方法[12],本研究選取2組健康大鼠作為運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組,于每日9：00點(diǎn)開(kāi)始跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),跑臺(tái)坡度設(shè)置為0°。首先進(jìn)行為期7d的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練(以10、15、20m/min的速度分別持續(xù)10min),待大鼠熟悉跑臺(tái)設(shè)備并能維持運(yùn)動(dòng)(以20m/min的速度持續(xù)30min)時(shí)開(kāi)始建模,持續(xù)14d,總時(shí)程為21d。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組設(shè)置速度為20m/min,時(shí)間為30min(相當(dāng)于30% VO2max);運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組則采用遞增強(qiáng)度的方式進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練,設(shè)置開(kāi)始的速度為10m/min,逐漸提高速度并在3min內(nèi)達(dá)到預(yù)定速度(19.3m/min,相當(dāng)于70% VO2max。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理后立即制備成全腦缺血再灌注模型。

每組又隨機(jī)平均分為6h,1、3、7d時(shí)間亞組,各時(shí)間點(diǎn)n=5。分別進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.3 組織標(biāo)本制備

按時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠用10%水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射麻醉, 4%多聚甲醛固定心灌流,切取約2mm 厚度冠狀背側(cè)海馬切片, 4℃4%多聚甲醛固定。24h以后對(duì)腦組織進(jìn)行常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片與貼片,切片厚度為4μm,45℃恒溫箱中烤干待用。同一層面相同切片進(jìn)行H-E染色和免疫組織化學(xué)顯色。

1.4 GAP-43、Nogo-A免疫組織化學(xué)顯色

切片常規(guī)脫蠟至去離子水,滴加復(fù)合消化液后加入37℃溫箱孵育20min,經(jīng)PBS洗滌,入3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15min,經(jīng)PBS洗滌后滴加兔抗大鼠GAP-43和Nogo-A多克隆抗體(1∶300稀釋),4℃過(guò)夜;PBS洗滌后滴加生物素化二抗,37℃ 40min,PBS洗滌;DAB顯色,蘇木精輕度復(fù)染,脫水透明,封片。用0.01mol/L PBS代替一抗孵育作為陰性對(duì)照。應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng),采用陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法,在相同光鏡倍數(shù)(40×10)下每只大鼠每個(gè)指標(biāo)選取5張腦組織切片,每一張切片在高倍視野鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野,計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),及棕黃色顆粒細(xì)胞,取均數(shù)作為每組該指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 組織材料的處理及總RNA提取

按時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物,冰上取出海馬組織,加入1ml RNAiso Plus溶液后勻漿,室溫靜置5min后12000r/min 4℃離心5min,取上清移至新的1.5ml離心管內(nèi),加入1/5 RNAiso Plus溶液體積的氯仿,震蕩混勻后室溫靜置5min,12000r/min 4℃離心15min,取上清液,加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇,室溫靜置10min,12000r/min 4℃離心10min,棄掉上清液,用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀,7500r/min 4℃離心5min,棄上清保留沉淀,干燥(不可加熱),溶解于30μl DEPC處理水中,測(cè)量OD260/280值,根據(jù)OD260計(jì)算RNA濃度,-80℃保存。

1.6 引物合成

參照CenBank公布的GAP-43、Nogo-A和GAPDH序列,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

1.7 RT-PCR

應(yīng)用ABI PRISM?7000和Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法,配置反應(yīng)體系為20μl的反應(yīng)液。進(jìn)行Real Time One Step RT-PCR反應(yīng)： Stage1、2(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))： Reps，1,42℃ 5min,95℃ 10s;Stage3(PCR反應(yīng))： Reps，40,95℃ 5s,60℃ 31s;Stage4(融解曲線分析)： Dissociation Protocol。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞核規(guī)則,核仁清晰。與假手術(shù)組比較,I/R組神經(jīng)元細(xì)胞胞體呈三角形,核皺縮深染,胞質(zhì)嗜伊紅,存活神經(jīng)元數(shù)量隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而減少,以3d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞壞死情況最為顯著(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組存活神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯高于I/R組,細(xì)胞核固縮深染及水腫情況減輕;而運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2組存活神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)一步減少,神經(jīng)元細(xì)胞固縮、深染情況顯著,出現(xiàn)較多細(xì)胞核丟失、空泡狀的非正常形態(tài)神經(jīng)元細(xì)胞(圖1,表2)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞壞死率的比較±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsI/R

2.2 GAP-43、Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)GAP-43、Nogo-A陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核,陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)可見(jiàn)細(xì)小的棕黃色顆粒。假手術(shù)組可見(jiàn)GAP-43、Nogo-A在胞質(zhì)有弱表達(dá)。與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注各組GAP-43、Nogo-A的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組GAP-43蛋白呈較高水平表達(dá),并隨時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì),于7d時(shí)達(dá)高峰,各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于I/R組(P<0.01);而運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組GAP-43蛋白表達(dá)顯著低于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組和I/R組(P<0.01)。此外,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組Nogo-A在6h 時(shí)明顯減少,并在1d時(shí)達(dá)低值,3d時(shí)有所上升,7d時(shí)達(dá)高值,但仍低于I/R組(P<0.01);運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組Nogo-A蛋白表達(dá)顯著高于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組和I/R組(P<0.01)(圖2)。

2.3 各組大鼠腦組織海馬區(qū)GAP-43、Nogo-A mRNA的表達(dá)

應(yīng)用相對(duì)定量方法比較目的基因和內(nèi)參基因之間的表達(dá)差異,采用2-△△Ct計(jì)算法顯示實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中基因表達(dá)的相對(duì)濃度。與假手術(shù)組比較,I/R組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43、Nogo-A mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組GAP-43 mRNA呈較高水平表達(dá),并隨時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì),于7d時(shí)達(dá)高峰,各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于I/R組(P<0.01);而運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組GAP-43 mRNA表達(dá)顯著低于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組和I/R組(P<0.01)。此外,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組Nogo-A mRNA表達(dá)在6h時(shí)明顯減少,并在1d時(shí)達(dá)低值,3d時(shí)有所上升,7d時(shí)達(dá)高值,但仍低于I/R組(P<0.01);運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組Nogo-A mRNA表達(dá)顯著高于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組和I/R組(P<0.01)(表3、4)。

表3 各組動(dòng)物海馬區(qū)GAP-43 mRNA的表達(dá)±s)

*P<0.05vssham group;△P<0.05vsI/R group

表4 各組動(dòng)物海馬區(qū)Nogo-A mRNA的表達(dá)±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsI/R

圖1 缺血3d各組海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元的H-E染色,×400。A： 假手術(shù)組；B： I/R組；C： 運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組；D： 運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組.

圖2 缺血3d各組大鼠CA1區(qū)GAP-43(A1～D1)和Nogo-A(A2～D2)免疫組織化學(xué)顯色,×400。A1/A2： 假手術(shù)組；B1/B2： I/R組；C1/C2： 運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理組；D1/D2： 運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理組.

Fig 1 H-E staining of neurons in the hippocampal CA1 region 3d after I/R in each group, ×400. A: Sham group; B: I/R group; C: Exercise intensity 1 group; D: Exercise intensity 2 group.

Fig 2 Immunohistochemistry staining of GAP-43 (A1-D1) and Nogo-A (A2-D2) in the hippocampal CA1 region 3d after I/R in each group, ×400. A1/A2： Sham group; B1/B2： I/R group; C1/C2： Exercise intensity 1 group; D1/D2： Exercise intensity 2 group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理促使腦缺血大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)目增多,而運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理則加重了腦組織的缺血缺氧程度,使神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)進(jìn)行性壞死。提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練預(yù)處理對(duì)腦組織的保護(hù)作用因強(qiáng)度差異而產(chǎn)生截然不同的效果。為探究其機(jī)制,觀察了實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)GAP-43與Nogo-A的表達(dá)變化。

GAP-43是神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白質(zhì),是神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)生長(zhǎng)、再生標(biāo)志蛋白[13]。Nogo-A是一種神經(jīng)軸突生長(zhǎng)相關(guān)蛋白,是抑制中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)重塑與再生的主要物質(zhì)[14]。近年來(lái),有學(xué)者[14-16]報(bào)道利用針康法、淫羊藿苷以及低氧療法等上調(diào)了腦缺血區(qū)皮層GAP-43的表達(dá),達(dá)到促使腦缺血大鼠腦缺血后神經(jīng)再生和恢復(fù)功能的作用;更有學(xué)者在大鼠局灶性腦缺血模型中通過(guò)電針、康復(fù)訓(xùn)練、中藥、Nogo-A受體拮抗劑等手段進(jìn)行干預(yù),表明抑制Nogo-A的表達(dá)可增強(qiáng)存活腦區(qū)神經(jīng)元的修復(fù)再生,部分重建喪失的神經(jīng)功能。

研究結(jié)果顯示,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理訓(xùn)練能夠上調(diào)腦缺血大鼠腦組織GAP-43的表達(dá),抑制Nogo-A的表達(dá),并提高其下降速度,使其在更短時(shí)間內(nèi)降至較低水平,從而維持神經(jīng)元的正常發(fā)育和存活,促使缺血損傷后突觸的形成及出芽。李超等[17]在腦梗死大鼠模型中證實(shí),每天10min的跑籠訓(xùn)練可促使大鼠抓握力的恢復(fù),梗死灶周?chē)窠?jīng)元數(shù)量顯著增多,且使Nogo-A蛋白水平表達(dá)下調(diào),改善軸突生長(zhǎng)的微環(huán)境。提示運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度1預(yù)處理通過(guò)減慢GAP-43隨著時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)降低的幅度,抑制Nogo-A的表達(dá)水平,為軸突再生提供基礎(chǔ),加強(qiáng)了神經(jīng)細(xì)胞軸突的修復(fù)和突觸間的連接再塑,進(jìn)而使中樞神經(jīng)功能的恢復(fù)得到進(jìn)一步改善。

研究還表明,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理使腦缺血大鼠腦組織海馬區(qū)GAP-43表達(dá)進(jìn)一步降低。Nogo-A表達(dá)增加并大量釋放,造成神經(jīng)元的不可逆損害,加重缺血損傷。樊振勇等[18]研究認(rèn)為,腦缺血再灌注后,GAP-43表達(dá)增強(qiáng)可能與損傷神經(jīng)的功能恢復(fù)相關(guān),運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的介入激活了神經(jīng)元，促進(jìn)了神經(jīng)元軸突的神經(jīng)突觸的連接重建以及修復(fù)、再生[19]。但大強(qiáng)度的極限負(fù)荷造成大鼠機(jī)體疲勞,過(guò)多的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)并不利于大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的再生,這種大強(qiáng)度的劇烈運(yùn)動(dòng)使海馬神經(jīng)元發(fā)生形態(tài)和功能變化,突觸傳遞效能下降,海馬的神經(jīng)元興奮性降低[20]。以上研究結(jié)果提示,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度2預(yù)處理誘導(dǎo)的氧自由基堆積,打破微環(huán)境平衡,促使Nogo-A過(guò)表達(dá),打破機(jī)體內(nèi)平衡狀態(tài),發(fā)揮抑制神經(jīng)再生的作用,同時(shí)下調(diào)GAP-43而抑制神經(jīng)再生,加重大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷,引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)機(jī)能的紊亂或下降。

綜上所述,Nogo-A蛋白的表達(dá)會(huì)使腦損傷的進(jìn)程加速,而GAP-43基因的表達(dá)促進(jìn)腦損傷修復(fù)和神經(jīng)再生。兩者相互制約和依存,協(xié)同調(diào)控機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促進(jìn)腦缺血大鼠梗死灶周?chē)S突出芽,但是由于受到不利微環(huán)境的影響,如運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和髓鞘形成抑制因子的影響,軸突再生受到很大程度的限制,影響功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果提示,不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及腦組織結(jié)構(gòu)具有截然不同的作用,與調(diào)控腦組織海馬區(qū)GAP-43和Nogo-A的表達(dá)有關(guān)。