沙蔥總黃酮對脂多糖誘導的小鼠腹腔 巨噬細胞炎癥介質的影響

王特日格樂 王翠芳 丹 妮 薩茹麗 杜紅喜 郭春利 哈斯額爾敦 曹琪娜 敖長金

(內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特010018)

炎癥是人和動物常見的病理過程，并出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、癢等典型癥狀。在炎癥發(fā)生過程中，致炎因素導致的組織損傷和機體啟動的抗損傷之間的優(yōu)勢對比決定著炎癥的發(fā)展方向和結局[1]。炎癥發(fā)生后，一般采用傳統(tǒng)的抗炎藥物進行治療，雖然這些藥物的抗炎效果較好，但是副作用也較大，因此，研發(fā)安全無副作用的替代品成為了新的熱點。病原微生物引起的炎癥過程中，致使單核巨噬細胞產生不同程度的增生。巨噬細胞是主要的炎性細胞，當其受到外界抗原刺激時會釋放白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等一系列炎性細胞因子，從而促進炎癥反應和組織損傷[2]。局部炎癥反應也會影響到整個機體，從而產生不同程度的全身性反應，但機體本身的狀態(tài)能夠制約局部炎癥的發(fā)生和發(fā)展[3]。所以，巨噬細胞對維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，維持機體免疫、抗炎等方面有著重要作用[4]。沙蔥，屬百合科、蔥屬，學名蒙古韭，具有藥用價值和功效[5]。沙蔥提取物含有酮類、醛類、糖類等多種活性物質，其中黃酮類化合物是重要的成分之一[6]。黃酮類化合物是一類重要的含氧雜環(huán)天然有機化合物，并具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌等作用[7-9]。所以，本研究以脂多糖(LPS)誘導的小鼠腹腔巨噬細胞為炎癥模型，探討沙蔥總黃酮的抗炎效果，為沙蔥黃酮類化合物的進一步開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

6～8周齡的C57BL/6J雄性小鼠，購自內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 藥物及試劑

沙蔥總黃酮[由本實驗室自己提取制備，提取率為(12.85±0.03) mg/g[10]]、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(7017946，BD)、LPS(L2880，Sigma)、胎牛血清(FBS，F(xiàn)ND500，ExCell Bio)、RPMI-1640培養(yǎng)基(C11875500BT，Gibco)、CCK-8(ck04，東仁化學科技有限公司)、二甲基亞砜(DMSO，D8371，Solarbio)、一氧化氮(NO)試劑盒(G2930，Promega)、RNA提取試劑盒(Axygen)、反轉錄試劑盒(RR047A，TaKaRa)、PCR試劑盒(RR820A，TaKaRa)、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(430904，Biolegend)、IL-6 ELISA試劑盒(431304，Biolegend)、IL-10 ELISA試劑盒(88-7105，Invitrogen)、IL-1β ELISA試劑盒(432604，Biolegend)。

1.3 試驗儀器

SynergyHT酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)、IX51倒置顯微鏡(奧林巴斯科技有限公司)、Roche480 PCR儀(羅氏診斷產品有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)、低溫離心機(上海鋪澤商貿有限公司)。

1.4 小鼠腹腔巨噬細胞的培養(yǎng)

取6～8周齡的C57BL/6J雄性小鼠，向其腹腔內注射3%的液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG) 2 mL，刺激72 h，脫頸法處死，于75%乙醇中浸泡2～3 min，在無菌超凈臺里暴露小鼠腹腔，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 mL，收集灌洗液，將灌洗液在5 000 r/min、4 ℃條件下離心3 min，棄上清，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，加入培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)[11-12]。

1.5 指標測定

1.5.1 CCK-8法測定細胞增殖率

將細胞以4×104個/孔接種于96孔板，貼壁2 h后，對照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基[13]，各沙蔥總黃酮組加入不同濃度的沙蔥總黃酮溶液，使其終濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL，分別培養(yǎng)24 h，再加入100 μL含10% CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長處測定吸光度(OD)值。

1.5.2 Griess法測定細胞上清液中NO含量

將細胞以2.5×105個/孔接種于24孔板，貼壁2 h后，用預冷的PBS洗滌細胞2次，分為對照組、LPS組(應激模型組，1 μg/mL LPS)[14-16]、沙蔥總黃酮低劑量組(25 μg/mL沙蔥總黃酮+1 μg/mL LPS)、沙蔥總黃酮中劑量組(50 μg/mL沙蔥總黃酮+1 μg/mL LPS)、沙蔥總黃酮高劑量組(100 μg/mL沙蔥總黃酮+1 μg/mL LPS)。對照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，LPS組添加終濃度為1 μg/mL的LPS，各沙蔥總黃酮組先用不同濃度沙蔥總黃酮溶液對細胞預處理1 h后再添加1 μg/mL的LPS共同處理24 h。收集細胞上清液，用Griees法測定NO含量。

1.5.3 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法測定細胞中TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶(iNOS) mRNA表達

將細胞以2.5×106個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，分組同上，培養(yǎng)2 h后將培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基棄掉，用預冷的PBS洗滌細胞2次，對照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，LPS組添加終濃度為1 μg/mL的LPS，各沙蔥總黃酮組先用不同濃度沙蔥總黃酮溶液對細胞預處理1 h后再添加1 μg/mL的LPS共同處理4及12 h。培養(yǎng)4及12 h后，棄掉細胞上清，用預冷的PBS洗滌細胞，添加細胞裂解液，反復吹打細胞，1.5 mL EP管收集細胞，提取細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書所述方法制備cDNA，通過特異性引物對細胞中TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS及其內參β-肌動蛋白(β-actin)進行擴增，基因引物序列見表1。本試驗RT-PCR采用20 μL試驗體系，其中無酶水6.4 μL,染料10 μL,上、下游引物各0.8 μL及逆轉錄反應產物2 μL。

表1 基因引物序列

1.5.4 ELISA法測定細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β的含量

將細胞以2.5×106個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，分組同上，貼壁2 h后用預冷PBS洗滌細胞2次，對照組添加含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，各沙蔥總黃酮組先用不同濃度沙蔥總黃酮溶液對細胞預處理1 h后再添加1 μg/mL的LPS共同處理24 h，收集細胞上清液。試驗方法按ELISA試劑盒說明書進行操作，在450 nm波長處測定OD值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，應用SAS 9.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結 果

2.1 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞增殖率的影響

如圖1所示，與對照組(0 μg/mL)相比，12.5～200.0 μg/mL濃度的沙蔥總黃酮均可顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的增殖率(P<0.05)，在12.5～100.0 μg/mL濃度，隨著沙蔥總黃酮濃度的增加細胞增值率也逐漸上升，當添加濃度為200.0 μg/mL時，細胞增殖率呈現(xiàn)下降趨勢，因此在后續(xù)的試驗中，將沙蔥總黃酮的添加濃度確定為25.0～100.0 μg/mL。

數(shù)據(jù)柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～圖7同。

Data bars with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.2 to Fig.7.

圖1沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞增殖率的影響

Fig.1 Effects of total flavonoids fromAlliummongolicumRegel on proliferation ratio of mouse peritoneal macrophages

2.2 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞上清液中NO含量的影響

如圖2所示，與對照組相比，LPS組小鼠腹腔巨噬細胞上清液中NO含量顯著提高(P<0.05)；與LPS組相比，不同濃度沙蔥總黃酮均能顯著抑制NO的產生(P<0.05)，并且呈劑量依賴性。

2.3 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA表達的影響

如圖3～圖7所示，在對照組細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOSmRNA表達量較低，但當單獨添加1 μg/mL的LPS對細胞刺激培養(yǎng)后，TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的表達均增加。與LPS組相比，除了低劑量組iNOS外，各濃度沙蔥總黃酮均能顯著抑制細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOSmRNA的表達(P<0.05)，并具有一定的劑量效應關系。而對于IL-10來說，在沙蔥總黃酮添加濃度為100 μg/mL時,IL-10 mRNA表達量最高，顯著高于對照組(P<0.05)，與LPS組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬 細胞上清液中NO含量的影響Fig.2 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on NO content in the supernatant of mouse peritoneal macrophages

圖3 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞 TNF-α mRNA表達的影響Fig.3 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on TNF-α mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖4 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔 巨噬細胞IL-6 mRNA表達的影響Fig.4 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on the IL-6 mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖5 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔 巨噬細胞IL-1β mRNA表達的影響Fig.5 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on IL-1β mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖6 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔 巨噬細胞IL-10 mRNA表達的影響Fig.6 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on IL-10 mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

圖7 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔 巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響Fig.7 Effects of total flavonoids from Allium mongolicum Regel on iNOS mRNA expression of mouse peritoneal macrophages

2.4 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10含量的影響

如表2所示，與對照組相比，LPS組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及抗炎因子IL-10的含量均顯著提高(P<0.05)；與LPS組相比，除了低劑量組的IL-1β，添加各濃度沙蔥總黃酮均能顯著降低小鼠腹腔巨噬細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量(P<0.05)；然而IL-10結果顯示，與對照組相比，添加沙蔥總黃酮高、中、低劑量均能不同程度地升高小鼠腹腔巨噬細胞上清液中IL-10的含量(P<0.05)。

3 討 論

一般情況下，當機體內的抗炎因子和促炎因子保持平衡時，機體的生理生化功能維持正常。但是當體內的細胞因子、炎癥因子等產生過多，超過機體自身的保護能力時，機體就會出現(xiàn)相應炎癥[17]。炎癥是機體對外抗衡的一種抗病反應，使細胞表面獲取更多的氧及營養(yǎng)物質，所以對機體有利。但是在一些外界因素影響下，抗炎因子也可以轉化成對機體有害的因素。炎癥分為慢性炎癥和急性炎癥，在急性炎癥所產生的高濃度炎癥因子的持續(xù)刺激下，急性炎癥會轉變?yōu)橄鄳穆匝装Y，慢性炎癥與冠心病、高血壓、甚至癌癥等一些慢性疾病有密切相關[18]。在炎癥反應中巨噬細胞的活化起著重要的作用，在未受到外界因素刺激時巨噬細胞并沒有表現(xiàn)出免疫功能[19]，但是當受到LPS等外界因素的刺激后，被激活的巨噬細胞釋放大量的細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等，這些細胞因子相互影響，在炎癥中起著重要的調節(jié)作用。因此，在本研究中選擇在炎癥反應中具有代表性的促炎因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α為測定指標，IL-1分為IL-1α和IL-1β 2種，IL-1α是一種結合性的細胞，只有與其他細胞相互結合后才能發(fā)揮作用；IL-1β在機體內有較強的生物學活性，能增強免疫細胞的殺傷力，引起炎癥反應，也能促進免疫應答反應[20]。IL-6在機體內有非常廣泛的作用，在免疫應答反應和細胞生長中起著很大的作用，同時刺激IL-1受體拮抗劑和可溶性TNF-α受體抑制IL-1、TNF-α等致炎因子的早期合成[21]。IL-10是機體內一種具有雙重作用的細胞因子，既有抑制免疫作用也有免疫刺激作用。IL-10還可以抑制單核巨噬細胞免疫介質的釋放，同時抑制促炎細胞因子的釋放[22]。TNF-α是巨噬細胞被激活時產生的一種細胞因子，是在炎癥反應中產生最早的炎癥介質，在機體內的一些生理反應中起著多方面的作用[23]。

表2 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.1 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞增殖率的影響

細胞活力是反映細胞增殖及細胞相對增殖率的重要的指標。巨噬細胞是機體內重要的免疫細胞，具有多種生物學功能，它能識別和吞噬入侵機體的一些病原及對機體產生危害的物質，引起機體的免疫應答反應[24]。且前人研究表明，在風濕性關節(jié)炎、纖維化肺炎及潰瘍性結腸炎等炎癥性疾病轉歸等方面巨噬細胞本身的一些功能有重要意義[25]。一些細胞炎癥因子、LPS等物質能激活巨噬細胞，其中LPS稱為內毒素，對單核巨噬細胞有很強的激活功能[26]。在本研究中發(fā)現(xiàn)沙蔥總黃酮能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的增殖率，當沙蔥總黃酮濃度為100.0～200.0 μg/mL時，細胞增殖率顯著升高，濃度在12.5～50.0 μg/mL時,增殖率明顯不及前者，但是當濃度達到200.0 μg/mL時，增殖率會出現(xiàn)下降趨勢，所以過低、過高濃度的黃酮類化合物都會影響細胞活力。

3.2 沙蔥總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO能力及相關炎性因子的表達和分泌的影響

在LPS等炎癥物質的刺激下，巨噬細胞的活性增強，并合成和釋放大量的NO、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12、IL-6等炎癥介質。在人體的病理過程中多種炎癥細胞和細胞因子相互作用，從而保證人體的正常生理過程[27]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮、黃酮醇、查爾酮等黃酮類化合物均能在細胞水平上抑制LPS誘導的核因子κB(NF-κB)靶基因的表達和IL-1產生，并抑制機體內外的炎癥反應[28]。急性肺損傷動物模型的研究結果表明，用黃酮醇、黃酮對動物進行干預后，動物機體支氣管肺泡灌洗液中的炎癥因子蛋白含量下降，嗜中性粒細胞減少，炎癥得到緩解[29]。丹參酮類成分是白花丹參主要有效成分之一，有較好的抗炎活性，丹參酮ⅡA通過抑制炎癥因子IL-10、TNF-α以及血小板的表達發(fā)揮抗炎作用[30]。甘草黃酮類單體異甘草素能抑制RAW264.7細胞IL-1β和IL-6基因表達及炎癥因子的釋放[31]。在體外抗炎研究中發(fā)現(xiàn)，茼麻葉總黃酮能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的炎癥因子的含量，同時能顯著提高IL-10的含量[32]。用LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型的研究也發(fā)現(xiàn)，一定濃度的伯葉黃酮能顯著降低細胞中TNF-α、NO、IL-6的含量[33]。黃酮類化合物還能抑制LPS所引起的下游NF-κB靶基因的表達、TAK1蛋白激酶激活和一些炎癥因子的釋放[34]，說明黃酮類化合物在體外抗炎反應中有很重要的作用。本研究結果表明，未受LPS刺激的巨噬細胞上清液中含有少量的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，當受到LPS刺激之后，上述炎癥因子的含量顯著提高；但給予黃酮類化合物后，能顯著降低這些炎癥因子的含量。同樣，IL-10在沒有LPS刺激前的含量很低，給予黃酮類化合物后，存在不同程度的上升。所以，沙蔥總黃酮能降低LPS炎癥模型中的細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表達量，并提高IL-10含量。

4 結 論

沙蔥總黃酮能提高小鼠腹腔巨噬細胞的增殖率，降低細胞上清液中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量以及細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表達，同時還能增加IL-10的含量以及IL-10 mRNA的表達。所以，沙蔥總黃酮對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞具有顯著的抗炎作用。