脂多糖致炎時間對小鼠血液免疫與 腸道組織形態(tài)的影響

賈軍峰 王夢竹 崔一喆 王秋菊 武 瑞

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的組成部分，可導(dǎo)致細胞因子紊亂，從而引發(fā)心血管衰竭和血壓不穩(wěn)定，并最終導(dǎo)致致命性敗血癥綜合征[1-2]。所以，監(jiān)測LPS致炎疾病發(fā)展的動態(tài)變化對防控LPS感染是非常重要的。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以促炎細胞因子作為生物標志物釋放的分子，如白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，在動物試驗中會降低腸道的屏障功能[3]。通?？梢酝ㄟ^比較健康動物與致炎動物之間的病理差異來尋找生物標志物[4]。目前，在研究炎癥模型過程中，通常腹腔單次注射高劑量LPS可致急性炎癥，此方法能引發(fā)腸道損傷，甚至導(dǎo)致全身的器官衰竭。間斷注射低濃度LPS會引起促炎細胞因子的持續(xù)增高，引發(fā)炎癥，但時間周期長。目前利用LPS復(fù)制炎癥模型，不同的研究選取時間點及小鼠品系并不統(tǒng)一，且只對促炎因子(TNF-α、IL-6)進行測定，對其他炎性細胞因子(IL-1β、IL-4、IL-8)和腸堿性磷酸酶(IAP)的測定較少[5-7]。研究表明，一些生物標志物在單一的時間點反映了重要的信息，但不能反映系統(tǒng)的動態(tài)變化[8]。因此，本試驗通過腹腔注射5 mg/kg BW LPS致炎雄性ICR健康小鼠(體重22～25 g)，之后連續(xù)監(jiān)測血液指標和腸黏膜變化情況，以全面了解在LPS給藥后血液細胞因子、IAP及腸道組織形態(tài)變化，為深入了解LPS對血液免疫和腸道組織形態(tài)隨時間的變化的研究提供基礎(chǔ)，為通過LPS建立腸道致炎模型提供合適的致炎時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LPS(來源于大腸桿菌O55∶B5)和其他化學(xué)試劑均從Sigma-Aldrich(美國)獲得。蒸餾水通過來自EMD Millipore Corporation(美國)的Milli-Q系統(tǒng)過濾獲得。將LPS溶于生理鹽水中并制成20 mg/mL的儲存液保存。在注射LPS之前將動物稱重，并且將LPS儲備液稀釋，以5 mg/kg BW的劑量對每只試驗小鼠進行注射。

1.2 試驗動物

雄性健康ICR小鼠，體重22～25 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SYXK(黑)2014005。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(22±2) ℃，相對濕度保持在(50±10)%，試驗期內(nèi)自由飲水、采食。動物試驗開始前先使小鼠習(xí)慣動物設(shè)施1周，動物試驗按照《實驗動物管理條例》(2017年修訂)執(zhí)行。

1.3 試驗設(shè)計和樣品采集

選取25只小鼠，按照5 mg/kg BW的劑量腹腔注射稀釋后的LPS溶液(0.5 mg/mL)，每只小鼠注射量約為0.2 mL。根據(jù)文獻[9]選擇時間點，在LPS注射前(0 h)和注射后3、6、12、24、48和72 h分別選出3只小鼠，通過沾有異氟烷的棉球?qū)⑿∈舐樽碇螅瑢π∈筮M行眼球采血，將血液樣品5 000 r/min離心10 min，吸取血清并于-80 ℃條件下儲存待測。采血后，斷頸處死小鼠，剖開腹腔，采集十二指腸、空腸、回腸及盲腸組織樣品。每個腸段取中間部分1～2 cm，滅菌生理鹽水沖洗干凈，置于4%甲醛緩沖溶液中固定，以備制作切片。

1.4 炎性細胞因子水平及IAP活性的測定

使用市售試劑盒(Endogen，英國)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法測定血清中炎性細胞因子水平及IAP活性。每次測定時，連續(xù)稀釋血清10～100倍，以確保獲得的值在每個試劑盒提供的標準線性范圍內(nèi)。每個來自同一小鼠的樣品重復(fù)測定2次，并取平均值。

1.5 組織病理學(xué)測定

參照Nabuurs等[10]的方法，將甲醛固定好的小鼠腸道組織包埋在石蠟中，切成4 μm的切片，并用蘇木精-伊紅(HE)染色溶液染色，然后在光學(xué)顯微鏡下(放大100倍)觀察染色的切片并照相。使用Image Pro Plus 4分析軟件(Media Cybernetics，美國)處理和分析系統(tǒng)評估絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)，并計算VH/CD(V/C)。每個腸道樣本至少測量10個數(shù)據(jù)，并計算平均值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 16.0的t檢驗對注射前和注射后不同時間點的差異進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清IAP活性和炎性細胞因子水平

給小鼠腹腔內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)腸黏膜炎癥，在注射前(0 h)和注射后不同時間點(3、6、12、24、48和72 h)血清IAP活性以及促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)和抗炎細胞因子(IL-4)水平的變化見圖1。

圖1顯示，腹腔注射LPS后小鼠血清中IAP活性和炎性細胞因子的水平瞬時升高，但不同炎性細胞因子的反應(yīng)時間模式不同。IAP活性，促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8以及抗炎細胞因子IL-4的水平在注射后6 h時達到高峰，隨后下降；而促炎細胞因子IL-1β的水平在注射后6 h時略有升高，在注射后48 h時達高峰。LPS注射后72 h時，上述炎性細胞因子在血清中的水平降至正常水平。

2.2 腸道黏膜組織病理學(xué)改變

對小鼠的組織病理學(xué)分析顯示，健康小鼠腸道黏膜的絨毛較長且比較完整(圖2)。與注射前(0 h)相比，LPS致炎小鼠在LPS注射后6 h病理變化比較明顯，小鼠腸道黏膜損傷明顯，上皮脫落、絨毛破裂、黏膜萎縮、水腫、且絨毛較短；隨著時間的推移，腸道黏膜在LPS注射后48 h時已開始緩慢恢復(fù)(圖2)。試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)所有LPS致炎小鼠在注射LPS 30 min后均產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥癥狀，如嗜睡、豎毛、腹瀉等，12 h后逐漸恢復(fù)。由此可以推斷，小鼠在LPS注射后6 h這段時間內(nèi)損傷嚴重，之后病理組織開始恢復(fù)。

“*”表示與0 h時相比差異顯著(P<0.05)。

“*” means significant difference compared with 0 h (P<0.05).

圖1LPS致炎小鼠血清中IAP活性和炎性細胞因子水平隨時間的變化

Fig.1 Changes of serum IAP activity and inflammatory cytokine levels of LPS induced mice with time

2.3 腸道組織形態(tài)學(xué)分析

由表1可知，與注射前(0 h)相比，注射LPS的小鼠十二指腸VH在注射后3(P<0.01)、6(P<0.01)、12(P<0.01)和24 h(P<0.05)時顯著或極顯著降低，空腸的VH在注射后12(P<0.05)和24 h(P<0.01)時顯著或極顯著降低，回腸的VH在注射后12 h(P<0.05)顯著降低。與注射前(0 h)相比，注射LPS的小鼠十二指腸的CD注射后6 h極顯著提高(P<0.05)，空腸的CD在注射后6(P<0.01)、12(P<0.01)、24(P<0.01)和48 h(P<0.05)時顯著或極顯著提高，回腸的CD在注射后12(P<0.01)、24(P<0.01)和48 h(P<0.01)時極顯著提高。與注射前(0 h)相比，注射LPS的小鼠十二指腸的V/C在注射后3(P<0.01)、6(P<0.01)和12 h(P<0.01)時極顯著降低，空腸的V/C在注射后3(P<0.05)、6(P<0.05)、12(P<0.01)、24(P<0.01)和48 h(P<0.01)時顯著或極顯著降低，回腸的V/C在注射后12(P<0.05)、24(P<0.05)和48 h(P<0.05)時顯著降低。由此可以看出，LPS可以降低VH、增加CD，從而使V/C迅速下降。但隨著時間的延長，這種差異逐漸消失。

放大倍數(shù)：100倍；比例尺：50 μm。

Magnification times: 100 times; scale: 50 μm.

圖2 LPS致炎小鼠腸道黏膜組織形態(tài)隨時間的變化

續(xù)表1項目 Items指標 Indices時間 Time/h03612244872回腸 Ileum絨毛高度VH/μm135.63±18.53129.38±3.14114.38±8.26103.75±8.29*110.63±19.83120.00±11.37131.88±16.63隱窩深度CD/μm42.50±9.3544.38±5.6945.00±4.3371.88±2.07**71.25±10.97**66.88±5.96**52.50±6.85絨毛高度/隱窩深度V/C3.36±1.102.96±0.422.58±0.481.44±0.07*1.61±0.48*1.81±0.30*2.54±0.40

*表示與 0 h時相比有顯著差異(P<0.05)，**表示與0 h時相比有極顯著差異(P<0.01)。

* means significant difference compared with 0 h (P<0.05), and ** means extremely significant difference compared with 0 h (P<0.01).

3 討 論

完整的功能性腸黏膜對健康和生存至關(guān)重要。作為病原體與腸道之間的主要介質(zhì)，腸道內(nèi)壁上皮細胞在防御病原體中發(fā)揮著重要作用[11]，而腸道上皮細胞的功能依賴于腸黏膜的穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，腸上皮細胞和免疫系統(tǒng)之間的平衡維持著腸道的健康[12]。由細菌內(nèi)毒素LPS觸發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)影響許多器官并可能導(dǎo)致死亡[13]。有研究表明，間斷注射低濃度LPS在第4周會導(dǎo)致慢性腸道炎癥[14-15]。Xu等[16]研究顯示，LPS處理后3～12 h，脾臟常規(guī)樹突狀細胞及其亞群的抗原水平呈遞逐漸增加，但在處理18 h后，這些物質(zhì)的抗原水平迅速下降。宣國平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，將10 mg/kg BW LPS經(jīng)大鼠尾靜脈注射6 h后可成功建立大鼠急性肺損傷模型。

IAP通過將革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素LPS功能區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白上的磷酸基團水解，使LPS的致炎能力喪失，達到解毒的目的[18]。研究表明，IAP在禁食期間不表達，并與增加的細菌移位和腸源性敗血癥有關(guān)[19]，且導(dǎo)致LPS去磷酸化活性降低[20]。基于這些觀察，我們推測IAP在調(diào)節(jié)宿主對活性內(nèi)毒素的反應(yīng)中起一定作用。

最近研究表明，促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)參與促成了炎癥性腸病(IBD)的持續(xù)存在和對組織的破壞[21]。其中TNF-α是促成IBD的關(guān)鍵因素，其功能包括將循環(huán)炎性細胞聚集到炎癥的局部組織部位，誘導(dǎo)水腫，參與凝血級聯(lián)的激活和肉芽腫的形成[22]。通過抑制TNF-α的表達來改善和緩解IBD癥狀的臨床試驗證明了TNF-α在IBD發(fā)病機理中的促炎作用[23]。Caradonna等[24]在2018年最新的研究顯示，促炎細胞因子IL-1β可以降低人類腸上皮細胞基因組的甲基化，卻在促炎基因IL-6和IL-8啟動子的CG特異位點誘導(dǎo)去甲基化，最終引起腸上皮細胞的炎癥反應(yīng)。而且Pendharkar等[25]在2018年最新的研究也表示促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的水平在發(fā)生胰腺炎癥時顯著升高。Yarur等[26]的研究顯示促炎細胞因子的釋放是炎癥通路被激活的直觀表現(xiàn)，腸道炎癥反應(yīng)與促炎細胞因子IL-6的水平呈正相關(guān)。

抗炎細胞因子和促炎細胞因子平衡失調(diào)時，就會引起炎癥并加劇[27]，LPS進入機體后刺激腸道，引發(fā)天然免疫系統(tǒng)應(yīng)答，造成腸道炎癥，導(dǎo)致促炎細胞因子IL-1β、IL-6等細胞因子的分泌量急劇增加，在注射后6 h時達到峰值，而后隨著時間的推移，釋放量慢慢趨于穩(wěn)定。LPS致炎模型的建立受不同的給藥方式、動物種系、LPS暴露時間等的影響。通過查閱文獻，確定腹腔注射能夠引起明顯的病理指標變化，且用此方法可以在較短的時間內(nèi)得到腸致炎模型[28]，在此基礎(chǔ)上，本試驗通過設(shè)置不同的時間梯度，以篩選出適合的致炎時間[29]。結(jié)果表明，給小鼠腹膜注射LPS引起了腸黏膜炎癥，其表現(xiàn)在于血清促炎細胞因子水平的升高，與此同時，由于機體內(nèi)負反饋調(diào)節(jié)的存在，血清抗炎細胞因子IL-4的水平也會隨著促炎細胞因子的大量釋放而稍有升高。血清炎性細胞因子水平的時間過程分析表明，這些炎性細胞因子的水平在注射后6 h時達到高峰，然后逐漸下降，并在注射后72 h時回到基線，與理論結(jié)果相似。由此可知，炎癥細胞因子與腸黏膜損傷的全過程有關(guān)，可作為腸黏膜損傷發(fā)病和發(fā)展的重要標志[30]。由本試驗結(jié)果可以看出，LPS注射6 h后腸道變化最明顯，因此，在建立LPS致炎或介導(dǎo)疾病模型時，應(yīng)以注射后6 h為最佳時間段，此時血清中炎性細胞因子的水平變化較大。本試驗中促炎細胞因子的大量釋放說明LPS刺激腸道可使胃腸黏膜上皮組織通透性增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成一系列的非機械性損傷，如圖2所示，在LPS注射后6 h時各腸段黏膜嚴重損傷，絨毛破裂，隨后腸黏膜開始緩慢恢復(fù)。

腸道黏膜的VH和CD與動物消化情況有密切關(guān)系[31]，檢測VH和CD可以判斷腸道黏膜損傷的程度和修復(fù)的能力[32]。例如，腹瀉發(fā)生率的降低伴隨著十二指腸和回腸VH的增加以及十二指腸CD的降低[33]。本試驗結(jié)果表明，LPS處理可使小鼠腸道黏膜VH降低、CD提高。絨毛萎縮可能是由細胞凋亡率增加或細胞更新率降低引起的[34]。VH和CD決定了絨毛的表面狀況，從而影響腸道的消化吸收功能[35]。小腸絨毛上皮處于不斷更新的狀態(tài)，在正常情況下具有很強的增殖和修復(fù)能力。損傷的絨毛可以在24 h內(nèi)修復(fù)以維持絨毛的正常組織結(jié)構(gòu)[36]。

在本次研究中，我們觀察到腸道組織的總體形態(tài)學(xué)變化，包括上皮細胞脫落、凋亡、絨毛破裂融合、黏膜萎縮、水腫等形態(tài)學(xué)改變。這些組織學(xué)損傷表明腸道屏障功能受損，可能導(dǎo)致滲透性增加。然而，腸黏膜損傷在LPS注射48 h后開始恢復(fù)，LPS注射12 h后血清細胞因子水平開始降低。

4 結(jié) 論

綜上所述，小鼠按每千克體重腹腔注射5 mg LPS誘導(dǎo)6 h時可產(chǎn)生最嚴重腸炎，之后逐漸恢復(fù)正常。